Методы работы с позвоночными животными в лаборатории. Упорядочить по номеру документа упорядочить по дате введения

Лабораторных животных разных видов и возрастов необходимо содержать в отдельных помещениях. При необходимости животных разных видов размещают в одном помещении в разных сторонах.

На каждой клетке, боксе, вольере вешают таблички, где записывают данные о животном и вид эксперимента.

Лабораторных животных содержат в клетках со сплошным дном или с поддонами. Подстилку: опилки, стружки, торф, солому - предварительно обеззараживают автоклавированием или в сушильном шкафу при температуре 160-200 0 С в течение 10-15 мин. При необходимости подстилку сжигают.

Клетки чистят ежедневно. Отходы и мусор из клеток, подстилку складывают в специальный железный бочок с плотно закрывающейся металлической крышкой. После заполнения бачки передают в дезинфекционно-моечные отделения для обеззараживания. Чистку, мойку обеззараживание клеток проводят в специальных помещениях. Трупы для вскрытия хранят в холодильнике не менее 1 суток.

Падеж или вынужденный убой животных регистрируется в специальном журнале.

В конце рабочего дня во всех помещениях (секциях) вивария проводят влажную уборку пола с применением дезинфицирующих веществ (1%-ые растворы хлорамина, едкого натрия и др.).

Существует три системы содержания и разведения лабораторных животных: открытая, закрытая и изолированная.

Закрытая система - при ней лабораторных животных содержат в хорошо освещенных специальных помещениях, где поддерживается стабильный автоматически регулируемый микроклимат и создаются условия, препятствующие возникновению инфекционных болезней.

Изолированную систему - применяют для выращивания линейных и стерильных (безмикробных) лабораторных животных (гнотобионтов).

В питомниках и вивариях животных разного пола, как правило, содержат отдельно. Для случки подсаживают самок к самцам, а не наоборот, так как самцы при помещении в другое помещение (клетку) становятся боязливыми и их внимание отвлекается от самки. После случки самку снова возвращают на прежнее место. При необходимости случку повторяют.

За оплодотворенными самками необходимо тщательно ухаживать, хорошо кормить, особенно к концу плодоношения. За несколько дней до появления потомства для самок готовят отдельную клетку. Клетка должна быть предварительно очищена и продезинфицирована, иметь достаточное количество сухой и мягкой подстилки.

Кроликов, морских свинок, крыс, мышей и др. мелких грызунов размещают по видам и возрасту в клетках. Если кролики содержаться на улице, то лучше строить двухъярусные секции, по нескольку секций в ряд, под одной общей водонепроницаемой двух - или односкатной крышей. Пол в клетках оборудуют реечный или сетчатый. В одной стороне клетки устраивают и кормушку и поилку. Для кроликов приняты следующие размеры клеток в см: длина 120-130, ширина 60-70, высота передней стенки 80-90, высота задней стенки 50-55. При содержании кроликов в помещении клетки лучше изготавливать металлические с двойным полом, между которым вставляют поддон. Размеры такой клетки (см): длина 70, ширина 45, высота 50. Двери изготавливают из проволочной сетки с ячейками размером 2-3 см.

Взрослых кроликов размещают по одному в клетке, молодняк до 3 мес. возраста по 3-5 голов. Крольчат в выгулах или в клетках содержат по 10-15 голов из расчёта 0,2-0,4 м 2 на крольчонка. Их необходимо сортировать и содержать по полу. В клетках оборудуют сетчатый пол на высоте 60-70 см от пола помещения и на расстоянии не менее 45-50 см от стен.

Для морских свинок используют двухъярусные клетки с закрытым верхом, непроницаемым для влаги. Примерные размеры одной клетки (см): длина 65 см, ширина 55, высота 40.

Клетки для мышей и крыс обычно металлические, с выдвижными металлическими противнями. Остов клеток изготавливают из углового железа, бока - из металлической сетки. Размеры такой клетки в см: длина 50, ширина 40, высота 30. Клетки ставят в 2 или 3 яруса на стеллажах из углового железа. Первый ярус должен приподниматься от пола на высоту 50 см.

Собак размещают индивидуально в отдельных боксах (кабинах) размером примерно 1,5 м 2 .

Кошек размещают в вольерах по 5 голов. Там же предусматривают устройство полок-лежаков. Площадь на одну кошку 0,5 м 2 . Перед входом в вольер оборудуют сетчатый тамбур.

Большинство видов лабораторных животных адаптируются на­столько хорошо, что живут и размножаются в самых неблагопри­ятных условиях. Мыши, например, могут переносить все - от тро­пических условий до температуры ниже нуля. Они размножаются даже в холодильниках, в которых хранят запасы замороженного мя­са. Но при какой-то температуре в пределах этого диапазона мыши чувствуют себя лучше всего, именно при этой температуре с не­большими колебаниями в обе стороны их следует содержать.

Свобода передвижения животных в помещении ограничена. Они проводят жизнь в клетках, т.е. в условиях микроклимата внутри клетки. Следовательно, в основу проектирования помещения для животных необходимо положить принцип создания таких ок­ружающих условий, которые обеспечивали бы необходимый мик­роклимат для животных и такие размеры и формы комнат, которые были бы удобны для обслуживающего персонала.

В вивариях и питомниках должны быть так же служебные по­мещения, необходимые в работе по уходу за животными. Практика показывает, что примерно половина общей площади помещения может быть отведена для размещения животных, а другая половина -под комнату для ведения всевозможных записей и т.д.

В небольших вивариях или питомниках указанные соотношения смещаются в сторону преобладания подсобных помещений. К со­кращению полезной площади приводит, также, необходимость соз­дания в них максимальных гигиенических условий, связанных с изо­ляцией животных, стерилизацией поступающих извне материалов и т.д.

Виварий (лат. Vivarium- заповедник для дичи, зверинец) - по­мещение для содержания и разведения лабораторных животных, ис­пользуемых для научных целей и в практике органов ветеринарии и здравоохранения. Виварии бывают весьма различные как по виду, так и по количеству находящихся в них животных, что определяется особенностями научных исследований. Виварии могут быть исполь­зованы не только для содержания, но и для увеличения поголовья лабораторных животных.

Разведение животных в вивариях практикуется обычно в тех случаях, когда для эксперимента необходимо иметь животных оп­ределенного вида, величины, массы, пола и возраста или выращен­ных в специальных условиях кормления, освещения и т.д. Кроме то­го, наличие в вивариях собственного питомника значительно об­легчит проблему бесперебойного снабжения лаборатории необхо­димым количеством мелких животных. В них могут проводиться не­которые научные исследования, например, по выяснению результа­тов длительного влияния различных пищевых рационов и др.

В лабораторной практике разделяют два понятия: виварий - по­мещение для содержания в надлежащих условиях животных, на­ходящиеся в состоянии опыта, и питомник - помещение для раз­множения и содержания животных до использования их. Беспере­бойное снабжение лаборатории животными возможно только при организации крупных питомников, руководимых квалифицирован­ными специалистами и находящихся под жестким ветеринарно-са-нитарным контролем.

Устройство виварий определяется в первую очередь видовым составом животных, в связи с чем различают виварии специализи­рованные (псарни, обезьянники и т.д.) и общего или комплексного типа, обеспечивающие содержание различных животных - собак, кошек, кроликов, морских свинок, белых крыс, мышей. Виварий

также могут включать аквариумы для пресноводных и морских жи­вотных, террариумы для амфибий и рептилий, вольеры и клетки для птиц и другие приспособленные помещения для разных видов мле­копитающих.

Различают помещения зимние и летние, постоянные и вре­менные (так называемые выгулы). В каждом виварий обязательно должно быть карантинное помещение для вновь поступивших и изо­лятор для заболевших животных (при работе с искусственно за­раженными животными всегда предусматривается постройка спе­циально устроенных изоляторов). Для ухода за животными после сложных операций в современных вивариях устраивают, так назы­ваемые клиники, где животным создают особенно благоприятные ус­ловия и где они находятся под постоянным наблюдением.

Клинические помещения могут также использоваться для дли­тельного содержания животных, требующих специального ухода. В случае необходимости при устройстве клиник предусматриваются как общие, так и одиночные палаты. Обязательно должны быть спе­циально оборудованные помещения, позволяющие проводить сан­обработку, как вновь поступивших животных, так и назначенных на операцию или используемых в длительных экспериментах, требую­щих соблюдения определенных санитарно-гигиенических условий (условно-рефлекторные опыты и др.).

В ряде случаев совершенно необходимо иметь в виварии спе­циально оборудованную дезинфекционную камеру, позволяющую быстро обрабатывать зараженные клетки, спецодежду сотрудников и подсобный инвентарь. Должно быть предусмотрено помещение для вскрытия павших животных и хранения трупов. Виварий обо­рудуются кухней с раздаточной, мойкой и складскими помещениями для хранения продуктов и запасного инвентаря (рис.87).

Необходимо уделять большое внимание вентиляции виварий. Обычные методы вентиляции простым отсасыванием воздуха из по­мещения для животных, как правило, оказываются недостаточными. Для удаления газообразных продуктов распада выделений живот­ных, устраивают приточно-вытяжную вентиляцию. Помещения ви­варий должны иметь водоустойчивый, например, каменный или це­ментный пол со сточными канавами и надежными трапами, что по-

(волит быстро производить уборку струей воды из гибкого шланга, подключенного к водопроводу. Чтобы можно было обмывать и де­зинфицировать стены, их облицовывают кафельной плиткой.

Следует отдать предпочтение относительно небольшим по­мещениям для животных. В них меньше шума, который беспокоит животных, их легче вентилировать и поддерживать в них чистоту, наконец, они представляют меньшую опасность в инфекционном отношении. По форме помещения для животных должны быть ско­рее удлиненными, а не квадратными, чем достигается более эко­номное использование пространства (рис.87).

Впрочем, в некоторых случаях более удобны квадратные поме­щения, при этом в центре комнаты остается достаточно места для работы. Так, например, в комнате размером 2,5x5,0 м с одной или двумя дверями, стеллажи с клетками удобно разместить вдоль длин­ных стен. Возможно также размещение стеллажей в центре комнаты с доступом к ним с двух сторон, однако, такое расположение стел­лажей менее экономично.

^ 0

Рис. 87. План вивария для лабораторных животных. Чистые служебные помещения: I - прихожая, туалет, душевые; 2 - контора; 3- кормокухня с недельным запасом кормов; 4 - стерилизационная; 5 - склад подстилочных материалов; 6 - склад клеток; 7- чистый коридор. Помещения для животных: 8 - подопытные животные; 9 - разведения животных: а - стел­лажи. Грязные служебные помещения: 10 - грязный коридор; 11-моечная; 12 - трупо- и мусоросжигалка.

Практика показывает, что в виварий должно быть четыре изол рованные секций. Первая секция предназначается для животны еще не взятых в опыты. Это секция для размножения животных возможно, для поступающих из вне (карантин), ее удобно называ секцией здоровых животных. Вторая - предназначается для по опытных животных. Сюда поступают животные из первой секции остаются здесь на все время опыта. Они не должны возвращаться в секцию здоровых животных. Эту секцию можно назвать секцией подопытных животных. В третьей секции хранятся корма, чистая подстилка, чистые и запасные клетки и другой инвентарь. Четвер­тая - предназначается для чистки клеток, грязной подстилки, тру­пов павших животных и т.д. Чистые клетки и другие предметы обо­рудования возвращаются на склад, откуда их доставляют для ис­пользования в ту или другую секцию для животных.

Большое внимание следует удалять сообщению-связи между на­званными секциями. В идеальном случае чистый и грязный пути циркуляции животных, кормов и инвентаря нигде не должны пере­секаться. В помещении для животных целесообразно устраивать две двери, одну из них для доставки чистых клеток, кормов и т.д., дру­гую для удаления грязных клеток. Таким образом, поток кормов и инвентаря все время идет в одном направлении от чистого к гряз­ному. Клетки и другие предметы оборудования после использования и чистки возвращаются в чистые секции лишь после стерилизации. Если устройство отдельных чистых и грязных переходов оказывает­ся невозможным, тогда одним и тем же переходом можно пользо­ваться с разной целью в разное время дня. Например, для движения грязных материалов - по утрам, а для чистых - во второй половине дня, после тщательного мытья и дезинфекции.

Наиболее удобная для работы удлиненная форма комнат для животных с пристеночным (а) и центральным (б) размещением стел­лажей (В) для клеток и водопроводной раковины (Г). Пристеночное размещение стеллажей, помимо удобства для работы, экономичнее центрального (рис.88).

Рис. 88. Схема размещения стеллажей в комнатах: а-пристеночное; б-центральное; В-клетки; Г-водопроводная раковина.

До сих пор обсуждение касалось помещений для животных в самой общей форме, без относительно того, предназначаются ли они для мышей, морских свинок, крыс или других животных. За немно­гими исключениями, все такие помещения должны быть пригодны для всех видов лабораторных животных. Дорогостоящий и благоус­троенный питомник или виварий не строится на 1-2 года, а виды жи­вотных, которые в нем содержатся, в разные годы могут быть раз­ными. В помещении, которое в этом году используется для мышей, в будущем году могут находиться кролики, и такая перемена должна происходить без серьезной перепланировки.

Содержание животных в питомниках должно по возможности соответствовать условиям существования их в природе. Это положение особенно относится к диким, родившимся на воле животным и птицам (дикие голуби, воробьи, домашние серые мыши и крысы). В небла­гоприятных для них условиях содержания и кормления эти животные быстро погибают в неволе (особенно воробьи и серые мыши). Обязательным условием успешной работы питомника является строгое соблюдение всех ветеринарно-санитарных, зоотехнических и зоогигиенических правил. Последние предусматривают содержание животных в просторных, светлых, сухих и чистых клетках, в хорошо вентилируемых, с нормальной температу­рой помещениях, рациональное и полноценное кормление и проведение про­филактических мероприятий в целях предупреждения различных заболе­ваний. Громадное значение для питомника имеет хороший состав произво­дителей (самцов и самок).

Питомник (виварий) должен иметь несколько отделений для содержания различных видов животных (кролики, морские свинки, мыши и т. д.). В структуру вивария входят:

1. отделение для карантинирования и адаптации вновь поступивших животных;

2. экспериментально-биологическая клиника для содер­жания животных, находящихся в опыте;

3. изоляторы для подозрительных на инфекционные заболевания и заведомо больных животных, уничтожение которых по условиям эксперимента нежелательно;

4. экспериментальное помещение (или манипуляционная), в котором осуществляются взвешивание, термометрия, заражение, вакцинация животных, взятие у них крови и не­которые другие процедуры.

Оборудование экспериментального помещения определяется в каждом конкретном случае задачами и условиями проводимых научных исследований.

Карантинное отделение, отделение для подопытных и изо­лятор для инфицированных животных размещаются в поме­щениях, строго изолированных одно от другого и от всех остальных помещений вивария.

Кроме основных перечисленных выше структурных еди­ниц, в составе вивария должны находиться:

а) кормокух­ня из двух смежных помещений для переработки и изго­товления кормов с самостоятельными выходами в коридор из каждого помещения, кладовая со специально оборудован­ными ларями (металлическими или обитыми внутри жестью) и холодильниками для хранения запаса кормов,

б) дезинфек­ционно-моечное отделение из 2 комнат, объединенных пере­ходным автоклавом или сухожаровой камерой.

Работа дезинфекционно-моечного отделения определяется состоянием материала, поступающего на обработку. Инфи­цированный материал, например клетки, подстилки, кор­мушки, вначале дезинфицируют, а затем подвергают механи­ческой чистке и мойке. Материал, не представляющий опас­ности для заражения, вначале подлежит механической очист­ке, а затем (при необходимости) стерилизации.

Моечное помещение в правильно организованном вива­рии имеет мусоропровод для удаления нечистот и грузоподъ­емник для доставки в виварий материала и оборудования.

Рядом с дезинфекционно-моечным отделением размеща­ются склад чистого (запасного) инвентаря с клетками, поил­ками, кормушками и т. п., бытовые помещения и санитарный блок (душевая и туалет) для обслуживающего персонала.

В соответствии с существующими санитарными правила­ми, виварий размещается в отдельно расположенном здании или на верхнем этаже лабораторного корпуса. При размеще­нии вивария в лабораторном корпусе он должен быть полно­стью изолирован от всех других помещений.

Виварий является важной частью научно-исследовательских институтов, лабораторий и других учреждений, где проводят исследования на животных. Для вивария совершенно не пригодны подвальные или неприспособленные помещения (сараи, пристройки и т. д.) с большой влажностью и сквозняками. Здание вивария, как и питомника для разведения животных, следует строить на возвышенном и сухом месте, с прилегающим к нему земельным участком. В виварии должно быть достаточно солнечного света, участок, прилегающий к помещениям, защищают от ветра. Территорию вивария обносят глухим забором; в непосредственной близости к основному помещению устраивают вольеры.

Здание вивария состоит из основных помещений, в которых содержат лабораторных животных, и подсобных. В каждой комнате вивария должны находиться животные одного вида. Как правило, крупных лабораторных животных (обезьяны, собаки) содержат в различных комнатах, также отдельно содержат кошек. Мелких животных (морские свинки, крысы, мыши) размещают обычно в одном помещении. Собак и кроликов можно содержать вне помещения, в клетках под навесом или в вольерах.

Важной и необходимой частью вивария являются подсобные помещения: кухня, комната для персонала, карантин, изолятор, мойка. Кухню для приготовления кормов оборудуют плитой и холодильником с подводкой горячей и холодной воды. Кухню размещают в одном здании вивария рядом с кладовыми для корма. Комнату обслуживающего персонала оборудуют индивидуальными шкафчиками для хранения спецодежды и спецобуви. К ней должна прилегать душевая установка для персонала вивария. Всех поступающих в виварий животных переводят в основное отделение только после пребывания в карантине. Помещение карантина должно быть изолировано и иметь все необходимое для ухода за животными. Наряду с этим необходимо иметь изолятор для заболевших или подозрительных по заболеванию лабораторных животных, а также помещение для вскрытия трупов. Предусматривается помещение для мойки, дезинфекции и сушки клеток и другого инвентаря вивария, а также спецодежды сотрудников. В виварии должна находиться печь для сжигания трупов и ванна для купания животных.

Необходимой частью вивария является клиника для животных. В клинику помещают после операций обычно собак; они находятся в ней до тех пор, пока не выйдут из тяжелого состояния после выполненного вмешательства. Клинику оборудуют специальными клетками или клетками обычного типа; в ней должны быть горячая и холодная вода, газ, аптечка с необходимыми лекарственными препаратами для выхаживания животных. В зависимости от характера проводимых исследований клинику оборудуют специальными станками для фиксации животных.

Полы вивария, особенно основного отделения, должны быть водонепроницаемыми и иметь уклон к стокам канализации. Полы покрывают пластиком, метлахской плиткой, бетонируют или в крайнем случае асфальтируют. Стены на высоту 2 м от пола покрывают глазурованной плиткой, пластиком или окрашивают масляной краской. Система канализации должна иметь широкие стоки, позволяющие избежать засорения, покрытые металлической решеткой. Сточные воды перед их поступлением в общую канализацию необходимо обезвреживать.

В помещениях вивария, помимо естественной вентиляции (форточки, фрамуги, открывающиеся окна), устраивают приточно-вытяжную вентиляцию с многократным обменом воздуха. Отопление вивария должно быть центральным, необходимо предупреждать появление сырости и поддерживать температуру в пределах 12-18°.

В зависимости от профиля научно-исследовательского учреждения (экспериментальная хирургия, нормальная и патологическая физиология, микробиология, токсикология и т. д.) при планировке вивария следует предусмотреть необходимые специальные дополнительные помещения. В ряде случаев выделяют изолированные помещения для содержания лабораторных животных, зараженных культурами возбудителей особо опасных инфекций и радиоактивными веществами, с операционной при каждом из этих помещений. Каждое помещение должно иметь холодильник и необходимое оборудование для заражения животных и вскрытия трупов.

Руководить виварием должен специалист-зоотехник, прошедший подготовку в области лабораторного животноводства.

Собаки . При клеточном содержании собак в основном отделении вивария не должно быть скученности, так как при этом создаются неблагоприятные санитарно-эпидемиологические условия с опасностью быстрого распространения инфекции на большую группу животных. Собак лучше помещать в отдельные небольшие комнаты с устройством в каждой из них 5-6 клеток.

При необходимости сбора мочи собак помещают в так называемые обменные клетки, пол которых устроен из сетки и подвижного лотка со стоком.

Собаки с беззвучным лаем. Поскольку содержание большого количества собак связано с определенными трудностями из-за шума, который создают лающие животные, в ряде случаев прибегают к перевязке возвратных нервов на шее с обеих сторон, в результате чего денервируются голосовые связки и собаки теряют способность лаять.

Техника операции. Оперируют животных под морфинным обезболиванием с добавлением местной анестезии (0,5 или 0,25% раствором новокаина) или под эфирным наркозом. Разрез кожи длиной 8-10 см проводят по срединной линии шеи от нижнего края щитовидного хряща вниз. Рассекают фасцию вместе с кожной мышцей шеи. Тупо разъединяют обе грудино-подъязычные мышцы, левую мышцу отодвигают кнаружи (рис. 1). В клетчатку между левой грудино-подъязычной мышцей и трахеей вводят раствор новокаина. Возвратная ветвь блуждающего нерва проходит в узкой щели между трахеей и пищеводом и прилегает к задне-боковой поверхности трахеи. Нерв обнаруживают в клетчатке на уровне 6-10-го кольца трахеи, выводят в рану тупым крючком и пересекают или резецируют на протяжении 1 см. Крючки извлекают и левую грудино-подъязычную мышцу укладывают на место. Таким же путем пересекают возвратную ветвь блуждающего нерва справа. Необходимо учитывать, что на уровне верхних колец трахеи возвратная ветвь блуждающего нерва делится на конечные ветви и принимает рассыпной тип. Пересечь при операции все мелкие нервные веточки не удается, и операция может не дать желаемого результата.

У собак после перерезки возвратных нервов наблюдаются явления дыхательной недостаточности, что делает их не пригодными для сложных экспериментальных операций (Л. М. Нагибин и др., 1967; Н. А. Супер и др., 1967).

Кошки . Содержать кошек в виварии трудно, поскольку они не переносят клеток. Для кошек отводят специальную комнату, где они имеют свободу перемещения. В этих условиях они могут жить в виварии длительное время. Комната должна быть светлой, теплой, хорошо вентилируемой, с полками для сидения кошек. На полу комнаты устраивают отхожее место, представляющее собой ящик, заполненный сухим песком, торфом, опилками. Ящик следует часто очищать, запах в комнате может быть устранен перманганатом калия.

Кролики и мелкие лабораторные животные . Животных содержат в клетках, размещенных на стеллажах, смонтированных в виде батарей, или комплектах клеток, расположенных на колесах. Клетки устанавливают на стеллажах на расстоянии 30-50 см от стен, нижний ряд клеток должен располагаться в 50- 70 см от пола. Между стеллажами оставляют проход не менее 1 м. Этажи клеток на стеллажах или батареях изолируют друг от друга водонепроницаемым материалом, исключающим попадание экскрементов на расположенные ниже клетки.

В зависимости от вида животного рекомендуются следующие размеры клеток (В. Н. Иванов, 1967): для мышей (10-20 животных) -200X300Х150 мм, для крыс (10- 15 животных) - 334X450X200 мм, для морских свинок (5-10 животных) - 486X450X200 мм, для кроликов (1-2 в зависимости от возраста и породы)-486X450X300 мм.

Клетки делают из различных материалов: жести, проволоки, стали,
фанеры, пластика и т. д. Они должны быть прочными и экономичными, легко очищаться, быть стойкими к дезинфицирующим веществам и термической обработке. Клетки из нержавеющей стали наиболее приемлемы для работы с радиоактивными изотопами.

Рис. 1. Операция выделения и пересечения ветвей возвратных нервов для создания беззвучного лая у собак.
1-левая доля щитовидной железы; 2 - возрастная ветвь блуждающего нерва; 3 - левая грудино-подъязычная мышца (оттянута крючком); 4 - пищевод; 5-трахея.

Комната, где располагаются клетки с животными, должна хорошо вентилироваться, относительная влажность воздуха должна быть в пределах 40-45%. Даже при наличии приточно-вытяжной вентиляции с целью снижения содержания в воздухе аммиака и продуктов жизнедеятельности животных рекомендуется применять торфяные подстилки или опилки с добавлением суперфосфата. Процесс уборки клеток может быть автоматизирован; уборка осуществляется 1-2 раза в сутки.

На передней стенке клетки устанавливают кормушку, автопоилку и вешают табличку, на которую заносят основные данные о животном, виде оперативного вмешательства и т. д.

Кроликов и морских свинок нередко содержат вне помещений вивария. Для этого используют клетки, располагая их в несколько ярусов, под общей крышей. Наружное содержание способствует выращиванию здоровых, более стойких к различным заболеваниям кроликов и большей частью распространено в питомниках.

Действующий

МУК 4.2.2939-11

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (В.В.Кутырев, И.Н.Шарова, Н.А.Осина, Е.С.Казакова, Е.А.Плотникова, С.А.Пионтковский, Т.Ю.Красовская, Д.В.Уткин, С.А.Щербакова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (С.В.Балахонов, Т.И.Иннокентьева, М.В.Чеснокова, А.В.Мазепа, С.А.Татарников); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (А.Н.Куличенко, О.В.Малецкая, Т.В.Таран, А.П.Бейер, А.В.Таран); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (В.В.Алексеев, А.В.Липницкий, В.А.Антонов, Д.В.Викторов); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина, Н.В.Аронова, Н.Н.Оноприенко, М.В.Цимбалистова, А.С.Водопьянов); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Противочумный центр" Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Г.Сенникова, М.В.Зароченцев, В.В.Мордвинова); Федеральным государственным учреждением науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, А.Н.Мокриевич, С.Ф.Бикетов, М.В.Храмов, Н.И.Лунева); Федеральным государственным бюджетным учреждением "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития (И.В.Борисевич, Л.В.Саяпина).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2011 г.

1. Область применения

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы и методы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, к биологической безопасности проведения работ.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за туляремией в Российской Федерации, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 3*.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" .
______________
Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" . - Примечание изготовителя базы данных.

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 29.10.2007 N 720* "О внесении изменений в пункт 5 Положения о лицензировании деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний ", утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 22.01.2007 N 31* .
________________
* Документ утратил силу на основании постановления Правительства Российской Федерации от 16 апреля 2012 года N 317

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера" (зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.04.2009 N 13745).

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 N 415н "Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения" (зарегистрирован в Минюсте Российской Федерации 09.07.2009 N 14292).

2.6. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности" (утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации от 28.08.1995 N 14).

2.7. СП 3.1.7.2642-10 "Профилактика туляремии" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.05.2010 N 61 "Об утверждении СП 3.1.7.2642-10" . Зарегистрировано в Минюсте РФ 7.07.2010 N 7745).

2.8. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15.04.2003 N 42 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.05.2003 N 4545).

2.9. СП 1.3.1318-03* "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 N 85 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 19.05.2003 N 4558).
______________
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать: СП 1.2.1318-03 . - Примечание изготовителя базы данных.

2.12. СП 3.4.2318-08 "Санитарная охрана территории Российской Федерации" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.01.2008 N 3 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.4.2318-08" . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 3.04.2008 N 11459).

2.13. СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.12.2010 N 163 . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 17.02.2011 N 19871).

2.14. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 18.05.2010 N 58 . Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 9.08.2010 N 18094).

2.15. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (утв. главным государственным санитарным врачом СССР от 6.04.73 N 1045-73).

2.16. МУ 3.1.2007-05 "Эпидемиологический надзор за туляремией".

2.17. МУ 3.3.2.2124-06 "Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии".

2.18. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

2.19. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

2.20. МУ 4.2.2495-09 "Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам".

3. Перечень сокращений

ЛПС - липополисахарид

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

ООИ - особо опасные инфекции

СП - санитарно-эпидемиологические правила

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормативы

МУ - методические указания

ПБА - патогенный биологический агент

МФА - метод флуоресцирующих антител

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РТНГА - реакции торможения непрямой гемагглютинации

РНАт - реакция нейтрализации антител

МИС - магноиммуносорбенты

РЛА - реакция латекс-агглютинации

ИХ - иммунохроматография

ИХ-тест - иммунохроматографический тест

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя туляремии

Туляремия - зоонозная системная природно-очаговая бактериальная инфекционная болезнь, характеризующаяся симптомами общей интоксикации, лихорадкой, воспалительными изменениями в области ворот инфекции, регионарным лимфаденитом, склонностью к затяжному течению.

Основными резервуарами и источниками возбудителя туляремии в естественных условиях являются дикие животные (около 50 видов), главным образом различные виды грызунов, и зайцы. На территории природных очагов туляремии могут заражаться овцы, свиньи, крупный рогатый скот. Резервуаром и переносчиками возбудителя являются также кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, комары, слепни, блохи. Больной человек эпидемиологической опасности не представляет.

Как и для всех зоонозов, для туляремии характерна множественность механизмов (аспирационный, контактный, фекально-оральный, трансмиссивный), а также путей и факторов передачи. В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (Десятый пересмотр. Женева, 2003, (МКБ-10), и по локализации основного патологического процесса различают следующие формы туляремии:

А21.0 - ульцерогландулярную (язвенно-бубонную);

А21.1 - окулогландулярную (глазо-бубонную);

А21.2 - легочную;

А21.3 - желудочно-кишечную (абдоминальную);

А21.7 - генерализованную;

А21.8 - другие формы туляремии (ангинозно-бубонную);

5.1.1. Требования к лабораториям лечебно-профилактических учреждений, осуществляющим исследования на туляремию

Лечебно-профилактические учреждения, лаборатории которых осуществляют диагностические исследования на туляремию, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей III-IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ЛПУ должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур холерных вибрионов (подозрительных) должны осуществляться в соответствии с действующими нормативными документами о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.



Проведение исследований на всех этапах - отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора - должно соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.



Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с освоением методов безопасной работы с возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие диагностические исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки в соответствии с номенклатурой проводимых исследований (прилож. 8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет и иметь сертификат специалиста.









Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях ЛПУ включает:












Правила ведения документации





Для забора материала и проведения диагностических исследований на туляремию в бактериологических лабораториях ЛПУ должны быть в наличии:





Персонал должен быть обеспечен спецодеждой и средствами индивидуальной защиты (для отбора проб клинического материала и проведения иммуносерологических реакций).

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В ЛПУ производят отбор клинического материала от лиц с подозрением на туляремию, больных различными формами туляремии и вакцинированных, а также секционного материала от умерших лиц.

В бактериологических лабораториях ЛПУ проводят исследования сывороток крови от больных туляремией и вакцинированных против туляремии лиц иммуносерологическими и аллергологическим методами:

1) выявление антител в парных сыворотках;

2) проведение реакции лизиса лейкоцитов.

Врач-инфекционист ЛПУ осуществляет оценку аллергологического статуса больных путем постановки аллергической пробы с тулярином.

5.1.3. Порядок лабораторной диагностики туляремии в лабораториях лечебно-профилактических учреждений

Отбор и транспортирование проб клинического материала

Материал от больных забирает медицинский персонал ЛПУ при поступлении больного, до начала лечения антибактериальными препаратами. Забор проб осуществляют два медицинских работника, один из которых врач-инфекционист или терапевт (хирург), подготовленный по вопросам диагностики особо опасных инфекций и соблюдения требований биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на содержание возбудителей инфекционных болезней I-II групп патогенности. Материал от вакцинированных лиц забирает медицинский персонал ЛПУ

Секционный материал забирают медицинские работники патолого-анатомических отделений (или БСМЭ) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям, руководствуясь действующими методическими указаниями по организации и проведению первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения, с соблюдением регламентированных требований биологической безопасности при работе с патогенными биологическими агентами I-II групп.

Для направления в бактериологические лаборатории учреждений Роспотребнадзора забирают:

от больных людей в зависимости от клинической формы болезни: содержимое бубона, материал из зева, с конъюнктивы глаза, отделяемое язвы, мокроту, кровь;

от умерших людей: увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки, трахеи;

от вакцинированных людей: кровь.

Забор проб всех видов материала осуществляют в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб.

Пунктат из бубона берут до 14-20 суток болезни шприцем емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70%-м спиртом, а затем смазывают 5%-м раствором йода и вновь протирают 70%-м спиртом. Иглу вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигло центральной части бубона, после чего, оттянув до отказа поршень, медленно вынимают иглу. Содержимое переносят в стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой. Можно перед взятием материала ввести в бубон 0,3-0,5 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида и затем отобрать содержимое. При вскрывшемся бубоне забирают материал отдельно из периферической плотной части и отделяемое свища.

Перед взятием отделяемого язвы, папулы, везикулы или отторгнутого струпа прединъекционной дезинфицирующей салфеткой осторожно очищают кожу вокруг пораженного места, при необходимости стерильной марлевой салфеткой удаляют некротические массы, гной. Прокатывая тампон по раневой поверхности от центра к периферии в течение 5-10 с абсорбируют материал на тампон. Тампон с материалом помещают в пробирку или транспортную среду. При использовании шприца иглу вводят у края везикулы (пустулы) и затем продвигают к середине. У язв пунктируют плотный край.

Мокроту собирают в специальные широкогорлые контейнеры с завинчивающейся крышкой.

Отделяемое слизистой зева забирают натощак или через 3-4 ч после еды. Аккуратно прижимая язык шпателем, вводят тампон между дужками миндалин и язычком (нельзя касаться тампоном губ, щек, языка) и собирают материал с задней поверхности глотки, миндалин и участков воспаления или изъязвления слизистой. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или в пробирку с транспортной или питательной средой.

Кровь для исследований берут с соблюдением правил асептики и мер индивидуальной защиты. Кровь забирают из локтевой вены в количестве 10-20 мл одноразовым шприцем и переносят в пробирку для посева на питательные среды и заражения биопробных животных, в пробирку с антикоагулянтом (4%-й раствор натрия цитрата в отношении 1:10 к объему крови или 6%-й раствор ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови) для ПЦР-анализа, в пробирку для получения сыворотки для иммуносерологических реакций.

Для постановки кровяно-капельной реакции агглютинации и реакции лейкоцитолиза кровь берут из пальца.

Отделяемое конъюнктивы глаза следует забирать до 17 суток болезни с помощью стерильного тампона, предварительно увлажненного 0,9%-м раствором натрия хлорида. Пробы из каждого глаза собирают отдельными тампонами двумя-тремя круговыми движениями по слизистой оболочке глаза. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или транспортную среду. При наличии обильного гнойного отделяемого стерильным сухим ватным тампоном берут гной с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. Необходимо следить, чтобы ресницы не касались тампона (придерживать веко рукой). Доставка материала в лабораторию в течение 1 ч, если используются специальные транспортные среды - в течение суток.

Емкости с пробами маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование. Контейнер с упакованным материалом опечатывают и отправляют в лабораторию с нарочным на специально выделенном транспорте. Поверхность стола после упаковки проб обрабатывают дезинфицирующим раствором.

На доставляемые в лабораторию пробы заполняют направление (прилож.1), в котором указывают: адрес учреждения, в которое направляется проба (пробы); фамилию, имя, отчество больного (умершего); пол, возраст, место жительства, дату заболевания, дату обращения за медицинской помощью, дату госпитализации, предварительный диагноз; особенности эпидемиологического анамнеза; проводилась ли больному до взятия материала антибактериальная терапия (когда, какие использовались препараты, в какой дозе); вид материала, взятого для бактериологического исследования; цель исследования; дату и час забора материала; адрес, по которому следует сообщить результаты бактериологического исследования; наименование учреждения, должность, фамилию и инициалы лица, направляющего пробу (пробы), подпись; время доставки пробы; должность, фамилию и инициалы принявшего пробы.

Материал транспортируют в лабораторию в сумке-холодильнике. В случае отсутствия условий для хранения материала на холоде время от момента взятия материала до начала исследования не должно превышать 5-6 ч.



Постановку и учет иммуносерологических реакций проводят в бактериологической лаборатории ЛПУ в соответствии с инструкциями по применению диагностических препаратов. В динамике заболевания исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Диагностически достоверным является 4-кратное и более увеличение титра антител.

Гиперчувствительность у больных и вакцинированных лиц определяют in vitro

Постановку и учет результатов аллергической пробы с тулярином (аллерген туляремийный жидкий, суспензия для накожного скарификационного нанесения) у лиц, зараженных или подозрительных на зараженность туляремией, осуществляет врач-инфекционист ЛПУ в соответствии с инструкцией по применению препарата.

Следует помнить, что аллергическая проба остается положительной у лиц, переболевших туляремией.

5.1.4. Оформление результатов исследования

Регистрацию результатов серологического и аллергического исследования сывороток на туляремию в бактериологических лабораториях ЛПУ осуществляют в соответствии с учетными формами, установленными в учреждении. Выдача ответов для историй болезней - по унифицированным формам.

5.1.5. Порядок взаимодействия лечебно-профилактических учреждений с организациями Роспотребнадзора

5.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе и административных районах субъекта, объединенных по территориальному признаку) в субъекте Российской Федерации

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на туляремию

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, на базе филиалов которого функционируют бактериологические лаборатории, должен иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II-IV (или III-IV) групп патогенности (опасности).

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации, выполняющие исследования на туляремию, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование проб клинического материала должны осуществляться в соответствии с действующими СП о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами.



Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на туляремию

Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с освоением методов безопасной работы с возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие диагностические исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки в соответствии с номенклатурой проводимых исследований (прилож.8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны иметь сертификат специалиста и повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория, выполняющая исследования на туляремию, должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Сотрудники учреждения, привлекаемые к эпизоотологическому обследованию энзоотичной территории, должны быть вакцинированы против туляремии с последующим контролем уровня иммунитета и регистрацией результатов в специальном журнале.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях включает:

контроль качества диагностических препаратов и тест-систем, дистиллированной воды, химических реактивов и дезинфицирующих средств;

своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

контроль работы бактерицидных ламп;

контроль температурного режима холодильников;

контроль температурного режима термостатов;

проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на туляремию

Для проведения диагностических исследований на туляремию в бактериологических лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" должны быть в наличии:

диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.3);

химические реактивы (прилож.4);

приборы, оборудование, расходные материалы (прилож.5, 6).

Рекомендуется для забора материала иметь комплект медицинский (укладку универсальную для забора материала от людей и из объектов окружающей среды для исследования на особо опасные инфекционные болезни).

Персонал должен быть обеспечен спецодеждой и средствами индивидуальной защиты.

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальных образованиях в субъекте Российской Федерации при осуществлении эпидемиологического надзора проводят контроль состояния противотуляремийного иммунитета у вакцинированных людей.

Исследования осуществляют в следующем объеме:

1) выявление антител;

2) постановка реакции лизиса лейкоцитов.

Если лаборатория ЛПУ не выполняет серологические исследования на туляремию, сыворотку больных или с подозрением на это заболевание исследуют в филиале ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации (по договоренности).

5.2.3. Порядок лабораторной диагностики туляремии в лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации

Состояние иммунитета у вакцинированных проверяют через 5 лет после вакцинации и в последующем - 1 раз в 2 года.

Контроль состояния противотуляремийного иммунитета осуществляют с помощью аллергологического (реакция лейкоцитолиза) или одного из серологических методов исследования (РА, реакция объемной агломерации, РНГА, ИФА). При этом предпочтительнее использовать серологические методы исследования. Материалом для исследования являются кровь и сыворотка крови вакцинированного. При необходимости можно использовать кровяно-капельную реакцию, которая позволяет выдать ответ в течение 5 мин и может быть поставлена с сухой каплей крови.

От больных или лиц с подозрением на туляремию в динамике заболевания исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Диагностически достоверным является 4-кратное и более увеличение титра антител.

Гиперчувствительность у вакцинированных и больных лиц определяют in vitro в реакции лейкоцитолиза в соответствии с действующими методическими указаниями по эпидемиологическому надзору за туляремией.

5.2.4. Оформление результатов исследования

Регистрацию результатов исследований в лабораториях филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации осуществляют в соответствии с учетными формами, установленными в учреждении. Выдача ответов - по унифицированным формам.

5.2.5. Порядок взаимодействия филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации с другими организациями Роспотребнадзора

Информация о результатах лабораторной диагностики туляремии в лаборатории филиала ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в субъекте Российской Федерации передаётся в соответствии с действующими нормативными документами.

5.3. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

5.3.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы и лаборатории особо опасных инфекций

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы или лаборатории особо опасных инфекций, соответствует порядку организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий филиалов ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации (раздел 5.2).

5.3.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации

5.3.2.1. Требования к лабораториям особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на туляремию.

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, на базе которых функционируют лаборатории особо опасных инфекций, выполняющие исследования на туляремию, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II-IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, осуществляющие исследования на туляремию, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами II-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими СП о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных подозрительных культур возбудителя туляремии и/или проб клинического материала должны осуществляться в соответствии с действующими СП о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с регламентированными санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с организациями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на туляремию

Исследования на туляремию могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности "Бактериология" с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп, имеющие допуск к работе с ПБА II-IV групп на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие исследования на туляремию, должны иметь необходимые профессиональные навыки (прилож.8).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны иметь сертификаты и повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория, осуществляющая исследования на туляремию, должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Специалисты, осуществляющие эпизоотологическое обследование энзоотичной по туляремии территории и его лабораторное обеспечение, должны быть вакцинированы против туляремии с последующим контролем уровня иммунитета и регистрацией результатов в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на туляремию в лабораториях ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" включает:

контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дисков с антибактериальными препаратами, дистиллированной воды, химических реактивов и дезинфицирующих средств;

своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

контроль работы бактерицидных ламп;

контроль температурного режима холодильников;

контроль температурного режима термостатов;

проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на туляремию

Для проведения диагностических исследований на туляремию в лабораториях должны быть в наличии:

питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.2);

диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож.3, 7);

химические реактивы (прилож.4);

приборы, оборудование, расходные материалы (прилож.5, 6);

комплект медицинский (укладка универсальная для забора материала от людей и из объектов окружающей среды для исследования на особо опасные инфекционные болезни).

Питательные среды подлежат обязательному контролю согласно действующим методическим указаниям по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям (для возбудителя туляремии).

5.3.2.2. Номенклатура и объем исследований.

Лаборатории ООИ ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, проводят:

исследование материала от больных и умерших с подозрением на туляремию;

исследование материала от лиц, подлежащих обследованию на туляремию в соответствии с требованиями эпиднадзора (по согласованию);

исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования территории;

исследование проб из объектов окружающей среды;

идентификацию выделенных культур возбудителя туляремии по сокращенной схеме;

контроль качества и ингибирующих свойств питательных сред.

Диагностические исследования материала осуществляют в следующем объеме:

а) индикация возбудителя в нативном материале методами экспресс- и ускоренной диагностики (МФА, ПЦР, ИФА, РА, РНГА, РНАт, селективное концентрирование на МИС с последующей постановкой ИФА);

б) постановка биологической пробы;

в) посев на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя;

г) выявление антител к возбудителю туляремии;

д) идентификация выделенной культуры по сокращенной схеме.

5.3.2.3. Порядок диагностических исследований на туляремию в лабораториях особо опасных инфекций ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации.

Порядок исследования клинического материала

Отбор материала осуществляют в соответствии с п.5.1.

Для выявления возбудителя туляремии используют диагностические препараты и сложные агаровые или желточные среды с добавлением цистеина, тканевых экстрактов, дефибринированной крови, глюкозы, зарегистрированные в установленном порядке. Каждая серия агара должна быть проверена на чувствительность к росту туляремийного микроба согласно действующим нормативно-методическим документам. Для подавления роста посторонней микрофлоры используют пенициллин (100 ед./мл), ампициллин (100 ед./мл), полимиксин В (50-100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин), амфотерицин В (или амфоглюкамин), ристомицина сульфат и некоторые другие антибактериальные препараты.

Объекты с посевами инкубируют при температуре 37 °С. Просмотр посевов осуществляют через 24-48 ч (далее - ежедневно в течение 10 суток от момента посева).

Подготовку проб для ПЦР осуществляют в соответствии с требованиями методических указаний по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.

Исследование материала от больного человека (трупа)

I этап:

приготовление мазков, окраска фиксированных мазков по Грамму, Романовскому-Гимзе, иммуноглобулинами флюоресцирующими туляремийными;

постановка ПЦР;

постановка иммуносерологических реакций для обнаружения антигенов и антител к возбудителю туляремии (РА, МФА, РНГА, РНАт, ИФА и др.);

постановка реакции лейкоцитолиза (кровь больного);

заражение биопробных животных (морские свинки внутрибрюшинно; белые мыши внутрибрюшинно или подкожно (кровь, пунктат бубона), подкожно (мокрота, мазок из зева, вскрывшийся бубон, отделяемое язвы, конъюнктивы);

посев на плотные питательные среды (кровь, пунктат бубона);

посев на плотные питательные среды с ингибиторами посторонней флоры (мокрота, мазок из зева, субстрат из вскрывшегося бубона, отделяемое язвы, конъюнктивы).

II этап (2-6 ч от начала исследования):

учет результатов МФА, ИФА, ПЦР;

учет результатов РА, РПГА и РНАт через 18-24 ч;

выдача предварительного положительного ответа на основании наличия в мазках мелких кокковидных палочек грамотрицательных или сиреневого цвета при окраске по Романовскому-Гимзе, их специфического свечения при окраске мазка иммуноглобулинами флуоресцирующими туляремийными, положительного результата ПЦР, положительных иммуносерологических реакций при отрицательных контролях.

III этап (48-72 ч от начала исследования):

просмотр посевов нативного материала на агаровых пластинках;

бактериоскопия мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму);

постановка ИХ-теста для экспресс-идентификации туляремийного микроба с материалом из подозрительных колоний;

отсев подозрительных колоний туляремийного микроба на питательный агар для выделения чистой культуры;

выдача подтверждения предварительного положительного ответа на основании наличия характерного роста на плотных питательных средах, наличия в мазках из колоний мелких грамотрицательных кокковидных палочек, положительного ИХ-теста для экспресс-идентификации туляремийного микроба.

IV этап (3-5-е сутки от начала исследования):

после накопления чистой культуры постановка тестов для ее идентификации. Идентификацию выделенной культуры проводят по следующим тестам:

морфология клетки, характер окраски по Граму и иммуноглобулинами флуоресцирующими туляремийными;

характер роста на питательных средах FT-arape или на свернутой желточной среде Мак-Коя;

отсутствие роста на простых питательных средах (мясопептонном агаре и/или бульоне);

агглютинация культур специфической туляремийной сывороткой или постановка РЛА с выделенной культурой;

экспресс-идентификация туляремийного микроба с использованием ИХ-теста;

выявление видоспецифичных ДНК-мишеней методом ПЦР;

вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов.

V этап (5-15-е сутки от начала исследования):

учет результатов идентификации культур;

просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

вскрытие и исследование забитых биопробных животных;

выдача окончательного положительного ответа проводится на основании выделения чистой культуры туляремийного микроба из посевов нативного материала, его идентификации по морфологическим, культуральным свойствам, положительных результатов иммуносерологических реакций, наличию ДНК возбудителя, а также на основании выделения идентичных культур от павших или забитых лабораторных животных.

Вторая группа . Высоковосприимчивые, но малочувствительные млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных микробных клеток возбудителя туляремии, болеют тяжело, но быстро освобождаются от микроба, приобретая устойчивый иммунитет). К этой группе относятся полевая мышь, все виды крыс и сусликов, белки, бурундуки, бобры, ежи, выхухоль, кутора, белозубка и некоторые другие виды млекопитающих.

Третья группа . Маловосприимчивые и практически нечувствительные млекопитающие. К ним относится большинство хищных млекопитающих и сельскохозяйственных животных.

Схема исследования полевого материала

Лабораторное исследование полевого материала начинают сразу же после его поступления. Допускается его кратковременное хранение (не более 20 ч) при температуре от 4 до 6 °С. При вскрытии зверьков на месте сбора возможно хранение органов и доставка их в лабораторию в консерванте. Консервантами могут служить вазелино-парафиновая смесь (1 часть парафина и 10 частей вазелинового масла смешивают и стерилизуют 45 мин прогреванием на кипящей водяной бане), 5%-й раствор поваренной соли, кроме того, используют глубокое замораживание в жидком азоте и др. В консервантах и при низкой температуре органы животных можно сохранять в течение одного месяца.

Исследование проводят биологическим, бактериоскопическими (световая и люминесцентная микроскопия), бактериологическими (посев на питательные среды, выделение чистых культур и их идентификация), молекулярно-генетическим (ПЦР-анализ) и иммуносерологическими (РА, РЛА, РНГА, РНАт, РНАг, ИФА) методами. Схема исследования материала зависит от группы чувствительности животных и от того, в каком виде доставлен материал.

Мелких млекопитающих , добытых в природе орудиями лова или живыми, исследуют групповым методом, объединяя в одну пробу органы нескольких зверьков (5-10) одного вида и пойманных в одном месте.

Для исследования отбирают кусочки селезенки, печени, лимфатические узлы, кровь или "смывы" из грудной полости. Материал исследуют биологическим, молекулярно-генетическим и иммуносерологическими методами.

Суспензию органов используют для заражения биопробных животных и выявления антигенов и ДНК возбудителя туляремии. Сыворотку крови или "смывы" из грудной полости исследуют на наличие антител к возбудителю туляремии.

Трупы зверьков , погибших в природе, павших в лаборатории, или животных, у которых при вскрытии обнаружены патолого-анатомические изменения, характерные для туляремии, подвергают индивидуальному исследованию. Кусочки селезенки, печени, почек, лимфатические узлы, костный мозг исследуют биологическим, бактериологическим, молекулярно-генетическим и иммуносерологическими методами.

В условиях установленной эпизоотии при исследовании животных первой группы можно ограничиться посевом органов на питательные среды и бактериоскопией мазков из органов, сохраняя часть их на холоде до получения результатов исследований. В сомнительных случаях прибегают к биологическому методу. Животных второй и третьей групп биологическим методом исследуют обязательно.

Вероятность обнаружения возбудителя туляремии в органах животных первой группы при микроскопическом исследовании (лучше использовать люминесцентную микроскопию) значительно выше, чем при бактериоскопии мазков из органов трупов животных второй группы.

Домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, овцы, северные олени) относятся к видам, малочувствительным к туляремии (третья группа). При их исследовании используют главным образом иммуносерологические методы (РА, РНГА, ИФА), реже - внутрикожную пробу с тулярином. Бактериологический и биологический методы применяют только при обследовании павших, забитых или больных животных. Исследуют в первую очередь лимфатические узлы и селезенку. При серологическом исследовании следует учитывать возможность обнаружения перекрестных реакций с бруцеллами и микробной флорой кишечника животных. Целесообразно исследовать сыворотки домашних животных, по крайней мере, в двух серологических реакциях. Положительные реакции в РНГА следует контролировать в РТНГА.

Погадки хищных птиц и помет хищных млекопитающих рекомендуется исследовать индивидуально. Гибель туляремийного микроба в погадках и помете происходит быстро (в первые сутки; при отрицательных температурах, возможно, медленнее), в связи с чем биологическое и бактериологические исследования этого материала нецелесообразны. Пробы погадок и помета используют для поиска антигена возбудителя туляремии иммуносерологическими методами и ДНК методом ПЦР.

Кровососущих насекомых и других беспозвоночных животных исследуют групповым методом, в одну пробу объединяют насекомых или беспозвоночных животных одного вида (рода) и добытых из одного места.

Взрослых иксодовых клещей объединяют до 50 особей.

Личинок объединяют по 100-200 экземпляров, нимф - по 50-100 в зависимости от степени их упитанности. Промывание личинок и нимф иксодовых клещей в спирте не проводят, т.к. это может повредить анализу.

Блох, гамазовых клещей, вшей сортируют по видам (родам), а также по видам зверьков, с которых они были собраны, помещают в стерильные пробирки и далее подвергают обработке по той же методике, что личинок и нимф иксодовых клещей.

Кровососущих двукрылых насекомых усыпляют парами эфира для ограничения подвижности. У слепней предварительно отстригают конечности и крылья, комаров и мошек исследуют целиком. В один анализ включают до 25-50 слепней или до 100 комаров, или до 250 мошек.

Гидробионтов - ручейников, бокоплавов, дафний, циклопов и других перед исследованием промывают в нескольких порциях воды и 1-2 порциях стерильной дистиллированной воды. У животных, имеющих чехлики или раковинки, последние по возможности удаляют. Животных объединяют в группы по 5-10-50 экземпляров в зависимости от размеров особей отдельных видов.

Обнаружение туляремийного микроба или его ДНК в организме беспозвоночных наиболее эффективно при использовании биологического метода и ПЦР. Также возможно обнаружение специфического антигена туляремийного ЛПС с помощью ИХ-теста.

Пробы воды (100-200 мл) берут из различных водоемов: речек, ручьев, прудов, озер, болот, колодцев и т.п. Наиболее эффективно исследование воды в поименно-болотных очагах туляремии в зимнее время. Пробы берутся в затененном месте, на глубине 10-20 см от поверхности стоячей или слабопроточной воды. Из каждой точки следует брать по 2 пробы. Отбирают пробы в местах обитания зверьков (возле кормовых столиков, нор, хаток бобров или ондатр). Для концентрирования возбудителя используют фильтрование, центрифугирование, магнитные сорбенты и другие приемы. Для исследования используют биологический метод (белой мыши вводят подкожно до 1 мл, а морской свинке - до 5 мл воды), молекулярно-генетический и иммуносерологические методы, направленные на выявление ДНК и антигенов возбудителя туляремии.

Произошла ошибка

Платеж не был завершен из-за технической ошибки, денежные средства с вашего счета
списаны не были. Попробуйте подождать несколько минут и повторить платеж еще раз.