Farmaci a base di oligonucleotidi. Oligonucleotidi antisenso come farmaci

Un oligonucleotide è un breve pezzo di acido nucleico di lunghezza inferiore a 50 nucleotidi. Negli ultimi 20 anni, il significato si è ampliato per includere tutti gli acidi nucleici sintetizzati chimicamente, indipendentemente dalla lunghezza. La prima pubblicazione sulla sintesi chimica mirata di un oligonucleotide apparve nel 1955.

Da allora, milioni di oligonucleotidi sono stati sintetizzati ogni anno per essere utilizzati nei laboratori di tutto il mondo. La maggior parte degli studi richiede solo piccole quantità di DNA. Sono necessarie quantità molto maggiori di DNA (10 µmol o più) per l'uso negli studi biofisici (NMR e cristallografia a raggi X), quindi per consentire la sintesi di quantità così grandi sono stati sviluppati metodi di sintesi in fase solida che ne consentono l'uso di oligonucleotidi come molecole farmacologiche (ad esempio oligonucleotidi antisenso).

La sintesi di oligonucleotidi di DNA o RNA si riferisce alla sintesi chimica di frammenti di acido nucleico con strutture o sequenze chimiche definite di varie dimensioni.

Fig. 1. Strutture degli oligonucleotidi.

Il principio della sintesi in fase solida è stato sviluppato e applicato per la prima volta alla sintesi dei polipeptidi da Robert Bruce Merrifield, un biochimico americano che ha ricevuto il Premio Nobel per la Chimica nel 1984 per la sua invenzione della sintesi dei peptidi in fase solida. Si rese conto che la chiave per una sintesi di successo risiedeva nell'ancorare il primo monomero alla fase solida polimerica insolubile. Altri monomeri possono quindi essere collegati, uno per uno, all'estremità terminale immobile del polimero in crescita. Al termine della sintesi, la catena polimerica completata può essere staccata dal polimero insolubile e purificata. Questo processo è stato ottimizzato nel corso degli anni per essere altamente efficiente ed è ora diventato una tecnica fondamentale utilizzata nei sintetizzatori di oligonucleotidi automatizzati.

Per garantire la sintesi di successo degli oligonucleotidi, sono necessarie le seguenti condizioni:

• Tutti i reagenti devono essere solubili in solventi non acquosi.
• I gruppi amminici e ossidrilici delle basi nucleotidiche e dei residui di carboidrati devono essere opportunamente bloccati.
• I gruppi protettivi introdotti durante la sintesi devono essere stabili in condizioni di allungamento della catena durante la formazione di un legame fosfodiestere internucleotidico.
• I gruppi protettivi devono essere sufficientemente labili da poter essere rimossi al termine della sintesi senza danneggiare i prodotti di reazione.

Funzioni degli oligonucleotidi e prospettive per la loro applicazione

Attualmente, gli oligonucleotidi e i loro analoghi sono ampiamente utilizzati in vari campi, come la medicina e la ricerca in biologia molecolare, e sono anche considerati agenti terapeutici e sonde promettenti per la diagnostica molecolare.

Negli ultimi 20 anni, solo due tipi di analoghi dell'acido nucleico con una spina dorsale formalmente elettricamente neutra sono stati studiati relativamente bene: acidi nucleici peptidici e oligonucleotidi di fosforodiammide morfolino. Gli analoghi di entrambi i tipi sono in grado di legarsi in modo complementare alle molecole naturali di DNA e RNA, e quindi hanno trovato applicazione sia in biologia molecolare che, in particolare, in medicina come potenziali farmaci.

Inoltre, con lo sviluppo delle tecnologie del DNA, è diventato possibile studiare l'espressione di geni conosciuti, determinare le mutazioni nei genomi di vari organismi e diagnosticare una serie di malattie infettive. Per risolvere questi problemi, il più promettente è l'uso di chip di DNA, che sono piccole piastre con frammenti di DNA depositati sulla loro superficie.

Il metodo per creare chip di DNA combina metodi basati sulla sintesi mirata di oligonucleotidi direttamente sulla superficie del chip. La sintesi viene effettuata mediante aggiunta graduale alla catena oligonucleotidica in crescita di nucleotidi contenenti un gruppo protettivo labile all'estremità 5', che può essere rimosso sotto l'azione della radiazione luminosa, della tensione elettrica o durante l'idrolisi acida.

È stato anche dimostrato che, a seconda del gene bersaglio selezionato, gli oligonucleotidi mirati al gene hanno una varietà significativa di effetti modulatori sui tessuti tumorali, che vanno dal rallentamento e dall'arresto della proliferazione delle cellule tumorali e terminano con la soppressione delle loro proprietà invasive.

I farmaci antitumorali a base di acidi nucleici sono uno strumento altamente specifico per modulare l'espressione genica. La soppressione di un certo numero di geni che sono sovraespressi in modo anomalo durante la trasformazione neoplastica può essere ottenuta con farmaci a base di acido nucleico come gli oligonucleotidi antisenso (asON). In generale, il meccanismo di soppressione dell'espressione genica consiste nel loro legame complementare all'mRNA bersaglio, dopodiché l'mRNA bersaglio viene scisso o il suo processo di traduzione viene bloccato.

asON sono DNA sintetici a filamento singolo lunghi 15-20 nucleotidi. Recentemente sono stati ottenuti asON in grado di impedire il trasporto dell'mRNA splicing dal nucleo al citoplasma, nonché asON, che, bloccando il sito di splicing nel pre-mRNA, possono portare all'espressione di un variante proteica alternativa.

A causa del fatto che gli oligodeossiribonucleotidi naturali nella coltura cellulare e in condizioni in vivo subiscono una rapida degradazione sotto l'azione delle nucleasi, nella struttura aON vengono introdotte varie modificazioni chimiche per aumentarne la stabilità.

Sintesi chimica di oligonucleotidi

La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata nella sintesi di peptidi, nella sintesi di oligonucleotidi, nella sintesi di oligosaccaridi e nella chimica combinatoriale. La sintesi chimica allo stato solido è stata inventata negli anni '60 da Bruce Merrifield e ha ricevuto il Premio Nobel per la chimica nel 1984.

La sintesi in fase solida viene effettuata su un supporto solido, tra filtri, in colonne che consentono il passaggio di tutti i reagenti e solventi. La sintesi in fase solida presenta una serie di vantaggi rispetto alla sintesi in soluzione:

 fornisce un'elevata velocità di reazione

 Le impurità e i reagenti in eccesso vengono lavati via, quindi non è necessaria la pulizia dopo ogni passaggio

 il processo è suscettibile di automazione su sintetizzatori in fase solida controllati da computer.

I veicoli solidi (chiamati anche resine) sono particelle insolubili in acqua, tipicamente di 50-200 µm di diametro, a cui è attaccato un oligonucleotide durante la sintesi.

Ci sono prove che uno dei materiali più efficaci che possono essere utilizzati come supporto solido è il vetro poroso. È abbastanza rigido e non in grado di gonfiarsi. Nei suoi pori profondi avviene la sintesi di oligonucleotidi. Il vetro contiene pori da 500 Å (50 nm), adatti per la sintesi di oligonucleotidi corti. Tuttavia, è poco adatto per la sintesi di oligonucleotidi di lunghezza superiore a 40 basi. Ciò è dovuto al fatto che l'oligonucleotide in crescita blocca i pori e riduce la diffusione dei reagenti attraverso la matrice.

I supporti solidi per la sintesi di oligonucleotidi convenzionali sono tipicamente realizzati con un carico di 20-30 µmol di nucleoside per grammo di resina. La sintesi di oligonucleotidi a carichi più elevati diventa meno efficiente a causa dell'ostacolo sterico tra filamenti di DNA adiacenti attaccati alla resina.

Fasi della sintesi chimica degli oligonucleotidi

L'oligosintesi del fosforamidato procede nella direzione da 3' a 5' (opposta alla direzione da 5' a 3' della biosintesi del DNA nella replicazione del DNA). Viene aggiunto un nucleotide per ciclo di sintesi.

Riso. 2. Ciclo di sintesi dell'oligonucleotide del fosforamidato

All'inizio della sintesi dell'oligonucleotide, il primo nucleoside è pre-attaccato alla resina (carrier) e le colonne di sintesi A, G, C o T vengono selezionate a seconda del nucleoside all'estremità 3' dell'oligonucleotide desiderato. Il nucleoside ancorato ha un gruppo protettivo 5'-DMT (DMT=4,4'-dimetossitritile) il cui ruolo è quello di prevenire la polimerizzazione e questo gruppo protettivo deve essere rimosso (detritilazione). Il meccanismo di detrializzazione è mostrato nella Figura 3.

Fig.3. Protezione del meccanismo di rimozione del gruppo.

Dopo la detritilazione, il nucleoside ancorato è pronto a reagire con la base successiva, che viene aggiunta come monomero nucleoside fosforammidato. Un grande eccesso del nucleoside corrispondente viene miscelato con un attivatore (tetrazolo o suoi derivati). Il gruppo diisopropilamminico del nucleoside viene protonato dall'attivatore e diventa così un gruppo altamente staccabile. Viene rapidamente spostato dal gruppo 5'-idrossile del nucleoside legato, creando un triestere fosfito (Fig. 4).

Fig.4. Il meccanismo di protonazione da parte di un attivatore.

Le fosforamiditi nucleosidici sono abbastanza stabili in un'atmosfera inerte e possono essere prodotte in grandi quantità, spedite in tutto il mondo e conservate come solido secco per diversi mesi prima dell'uso.

Tuttavia, anche con un lavoro di sintesi di oligonucleotidi ad alta precisione, rimane la possibilità che ci saranno alcuni gruppi 5′-idrossile non reagiti che saranno disponibili per partecipare alla fase successiva. Se tale interruzione non viene interrotta, si accumuleranno ad ogni ciclo successivo e il prodotto finale sarà una complessa miscela di oligonucleotidi, la maggior parte dei quali conterrà informazioni genetiche errate.

Pertanto, il metodo di acetilazione dei gruppi 5'-idrossile li rende inerti rispetto alla successiva reazione. Ciò è necessario anche per ridurre al minimo le impurità.

Il fosfito triestere (P(III)) formato nella fase di addizione è instabile agli acidi e deve essere convertito nella forma stabile (P(V)). Ciò si ottiene grazie all'ossidazione dello iodio in presenza di acqua e piridina (Fig. 5). Il fosfotriestere risultante è in realtà un asse del DNA protetto da un gruppo 2-cianoetile. Il gruppo cianoetile previene reazioni indesiderate con il fosforo durante i successivi cicli di sintesi.

Fig.5. Il meccanismo dello stadio ossidativo.

Successivamente, il gruppo protettivo DMT all'estremità 5' del filamento di DNA deve essere rimosso in modo che il gruppo idrossile primario possa reagire con il successivo nucleotide fosforammidato. La reazione di deprotezione con acido tricloroacetico in diclorometano è veloce. Il ciclo viene ripetuto, una volta per ciascuna base, fino ad ottenere l'oligonucleotide desiderato.

Successivamente, è necessario staccare l'oligonucleotide sintetizzato dal supporto solido. In questo caso viene utilizzato il succinile. La separazione è possibile se trattata con ammoniaca acquosa concentrata a temperatura ambiente per un'ora (Fig. 6).

Fig.6. Meccanismo di separazione di un oligonucleotide da un veicolo solido in una soluzione acquosa concentrata di ammoniaca.

La reazione di clivaggio viene eseguita automaticamente su alcuni sintetizzatori e la soluzione di ammoniaca contenente l'oligonucleotide entra in una fiala di vetro. In alternativa, la digestione può essere eseguita manualmente prelevando la colonna dal sintetizzatore e risciacquando in siringhe contenenti idrossido di ammonio.

L'oligonucleotide viene sciolto in ammoniaca acquosa concentrata e il successivo riscaldamento consente la rimozione dei gruppi protettivi dalle basi eterocicliche e dai fosfati. La soluzione acquosa viene quindi rimossa per evaporazione e l'oligonucleotide è pronto per la purificazione.

Oltre al gruppo protettivo DMT, sono necessari anche gruppi protettivi aggiuntivi per adenina, citosina e guanina (Fig. 7). Tuttavia, questo non è necessario per la timina.

Fig.7. Strutture di gruppo protettive comunemente utilizzate per proteggere le basi di adenina, citosina e guanina durante la sintesi del fosforamidato degli oligonucleotidi del DNA.

conclusioni

1. Gli oligonucleotidi sintetizzati artificialmente sono sempre più utilizzati in vari campi della scienza e vengono sempre più migliorati i metodi per la loro preparazione, il che consente di sintetizzare un numero sufficiente di oligonucleotidi per esperimenti di laboratorio e per la creazione di farmaci terapeutici.

2. Ad oggi, il metodo più comune per la sintesi di oligonucleotidi è il metodo di sintesi in fase solida, che può accelerare significativamente il processo di ottenimento degli oligonucleotidi, nonché ridurre la quantità di reagenti esauriti.

Medicina per i geni

Il sogno di vecchia data dei medici è quello di avere a disposizione sostanze che agiscano su geni specifici, ad es. la causa principale di molte malattie. Infatti, sulla base di tali sostanze, è possibile creare farmaci: veri e propri "proiettili magici" che possono influenzare il materiale ereditario di vari agenti infettivi senza danneggiare il corpo umano, oltre a sopprimere l'attività degli oncogeni responsabili della crescita delle cellule maligne. La creazione di tali sostanze che hanno un effetto diretto sul materiale genetico è uno dei compiti principali della biologia molecolare, poiché possono essere utilizzate per studiare le funzioni dei geni e, in definitiva, controllare il lavoro di questi ultimi.

Ma come si può cambiare il programma genetico desiderato? Dopotutto, tutti i geni hanno una composizione chimica e una struttura simili: le differenze tra loro sono ridotte solo all'ordine di alternanza di quattro blocchi monomerici: nucleotidi A, T, G, C. Per agire su un determinato gene, una molecola di sostanza deve in qualche modo riconoscere questa sequenza nucleotidica - il compito, a prima vista, irrisolvibile.

Ma un gruppo di chimici siberiani che vennero all'Academgorodok di Novosibirsk nei primi anni della sua creazione la pensava diversamente. I dipendenti dell'Istituto di chimica organica della filiale siberiana dell'Accademia delle scienze dell'URSS (Novosibirsk) NI Grineva e DG Knorre, sulla base del principio del riconoscimento molecolare utilizzato dalla natura stessa, hanno formulato l'idea di un effetto diretto sui geni utilizzando oligonucleotidi - frammenti di acido nucleico "armati" con speciali gruppi chimici. I chimici siberiani hanno pubblicato il loro primo lavoro sugli oligonucleotidi nel 1967: questa data è considerata oggi la data ufficiale dell'emergere di una nuova direzione nella biologia molecolare e nella farmacologia.

Sono stati i primi

L'attuazione di questo progetto, inconsueto nella sua audacia (all'epoca non si prevedeva nemmeno di svolgere tale ricerca in nessuna parte del mondo) nella fase iniziale è stata realizzata da un piccolo gruppo di giovani dipendenti, dottorandi e studenti di NSU. Abbiamo dovuto ricominciare praticamente da zero, poiché a quel tempo non sapevano ancora sintetizzare oligonucleotidi in quantità apprezzabili; non c'erano strumenti tecnici necessari per lavorare con piccole quantità di acidi nucleici e un metodo efficace per determinarne la sequenza. I nostri chimici sono riusciti a risolvere questi problemi grazie all'interdisciplinarietà, uno dei principi che ha costituito la base delle attività del ramo siberiano.

NIOC ha organizzato la produzione di acidi nucleici, ha sviluppato metodi per la loro modifica chimica; insieme ai dipendenti dell'Istituto di Fisica Nucleare, è stato possibile creare dispositivi per l'analisi degli acidi nucleici e la manipolazione con le loro piccole quantità e, insieme ai chimici dell'Università statale di Mosca, hanno iniziato a lavorare alla creazione di sintetizzatori automatici di oligonucleotidi. Di conseguenza, praticamente tutti i metodi e gli strumenti analitici necessari erano a disposizione degli scienziati: la ricerca biologica poteva iniziare.

Esperimenti effettuati prima su modelli semplici e poi su acidi nucleici naturali hanno mostrato che gli oligonucleotidi interagiscono effettivamente con gli acidi nucleici bersaglio con un elevato grado di selettività. Nel caso in cui gruppi reattivi siano attaccati agli oligonucleotidi, si verifica una modifica chimica mirata degli acidi nucleici bersaglio. Inoltre, è stato dimostrato per la prima volta che questi reagenti possono essere utilizzati per sopprimere le infezioni virali negli animali ed è stata dimostrata la possibilità di introdurli nell'organismo attraverso la pelle e le mucose, ecc.

Le prime pubblicazioni sugli effetti biologici prodotti dagli oligonucleotidi hanno suscitato grande interesse tra gli specialisti di tutto il mondo. Nel 1988 si tenne ad Akademgorodok il primo simposio al mondo sulle sostanze con targeting genetico a base di frammenti di acido nucleico. Scienziati provenienti da Stati Uniti, Francia e poi altri paesi si sono uniti al lavoro sulla creazione di tali farmaci; Decine di aziende sono emerse con l'obiettivo di creare farmaci terapeutici a base di oligonucleotidi.

Medicina complementare

I cosiddetti oligonucleotidi antisenso, progettati per l'inattivazione selettiva degli RNA virali e di alcuni RNA cellulari, sono diventati i primi farmaci a target genetico. Inizialmente, si presumeva che i gruppi reattivi sarebbero stati attaccati a questi oligonucleotidi, che avrebbero dovuto modificare o distruggere chimicamente gli acidi nucleici bersaglio. Tuttavia, si è scoperto che l'attaccamento di oligonucleotidi all'RNA bersaglio di per sé ha un effetto così forte su di esso che può provocarne la distruzione da parte degli enzimi cellulari.

Gli approcci antisenso basati sull'uso di nucleotidi e acidi nucleici per sopprimere l'attività biologica degli acidi nucleici offrono prospettive interessanti nei casi in cui è necessario sopprimere l'implementazione di informazioni indesiderate negli organismi viventi. Innanzitutto si apre la prospettiva di creare una nuova generazione di farmaci antivirali e antitumorali. Tali farmaci hanno un indiscutibile vantaggio rispetto ad altri... Tutti gli oligonucleotidi, indipendentemente dall'obiettivo a cui sono rivolti, possono essere creati utilizzando un'unica tecnologia. Solo la sequenza dei nucleotidi deve essere variata. In particolare, in virologia e oncologia, si ha spesso a che fare con un fenomeno come l'emergere della farmacoresistenza. Ciò accade più spesso perché una singola particella virale o una singola cellula cancerosa ha una mutazione che porta a tale resistenza. In ogni altro caso, dovrebbe essere avviata una ricerca empirica di un nuovo farmaco. Nel caso degli effetti antisenso, è solo necessario determinare quale cambiamento nella struttura del genoma virale o dell'oncogene ha portato all'emergere di resistenza. Dopodiché, diventa subito chiaro come creare un nuovo farmaco utilizzando la stessa tecnologia unificata*.

* Diario educativo di Soros. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Gli RNA interferenti, brevi complessi a doppio filamento di oligonucleotidi di RNA, si sono rivelati il ​​mezzo più potente per "spegnere" i geni. Quando un tale complesso viene introdotto in una cellula, uno dei filamenti si lega alla sua sequenza complementare nell'RNA messaggero della cellula. Questo serve come segnale per avviare il lavoro di un gruppo di enzimi che tagliano l'RNA associato agli oligonucleotidi. Di conseguenza, il programma per la sintesi di una determinata proteina scompare.

Nel 2006, due ricercatori americani hanno ricevuto il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina per aver spiegato il meccanismo dell'interferenza dell'RNA. La creazione di regolatori di espressione genica basati su RNA interferenti ha aperto grandi opportunità per ottenere un'ampia gamma di farmaci non tossici altamente efficaci che sopprimono l'espressione di quasi tutti i geni, compresi quelli tumorali e virali.

Mutazioni corrette

L'attenzione degli specialisti è stata a lungo attratta da metodi di azione mutagena sul DNA che utilizzano oligonucleotidi o loro derivati. In caso di successo, quella che oggi sembra una fantasia potrebbe diventare realtà: la correzione di programmi genetici difettosi.

È già stato sperimentalmente dimostrato che le mutazioni puntiformi possono essere introdotte nei programmi genetici utilizzando oligonucleotidi brevi. Come farlo? Gli oligonucleotidi mutageni contenenti blocchi nucleotidici "sbagliati" vengono introdotti nella cellula, dove vengono combinati con il DNA. Di conseguenza, in alcune parti delle sequenze nucleotidiche compaiono coppie di basi "sbagliate", cioè non complementari, che vengono percepite dal sistema di riparazione del DNA cellulare ("riparazione") come danno. I nucleotidi in una tale coppia sono sostituiti da enzimi riparativi in ​​modo tale da diventare "corretti", complementari. In questo caso la sostituzione può avvenire sia nella sequenza oligonucleotidica che nel DNA cellulare stesso.

In quest'ultimo caso si tratta di un cambiamento nel programma genetico, cioè di una mutazione. E sebbene l'efficienza di un tale processo di mutazione sia generalmente bassa, può essere utilizzato in relazione alle nuove tecnologie cellulari. Ad esempio, le cellule staminali di un paziente con qualche malattia ereditaria possono essere trattate con un mutageno selettivo, e quindi possono essere selezionate quelle in cui si è verificata la mutazione desiderata (cioè cellule con un programma genetico "corretto"), moltiplicato e introdotto nel corpo.

Pertanto, gli oligonucleotidi attualmente esistenti sono in grado di regolare il "lavoro" dei geni a vari livelli. Pertanto, i suddetti oligonucleotidi antisenso e RNA interferenti agiscono nella fase della sintesi proteica, agendo sugli RNA messaggeri - molecole di informazione in cui sono assemblate le catene polipeptidiche. Gli oligonucleotidi antigenici che formano complessi con il DNA sopprimono l'espressione genica: la formazione degli stessi RNA messaggeri e gli oligonucleotidi aptameri, come gli anticorpi, possono formare legami con determinate proteine, bloccandole. Inoltre, alcuni oligonucleotidi sono in grado di stimolare il sistema immunitario: oggi vengono utilizzati come componenti dei vaccini.

Attualmente, lo sviluppo e la sintesi di oligonucleotidi e loro analoghi sono effettuati da grandi settori di ricerca e industriali. Quindi, l'anno scorso, il volume del mercato degli oligonucleotidi destinati ai soli scopi di ricerca ha superato gli 800 milioni di dollari! Decine di nuovi tipi di oligonucleotidi chimicamente modificati sono stati ora sviluppati e sintetizzati e sono in fase di sperimentazione una serie di farmaci antivirali e antinfiammatori basati su di essi. Ricerche di questo tipo in Russia sono attualmente svolte principalmente presso l'Istituto di biologia chimica e medicina fondamentale della filiale siberiana dell'Accademia delle scienze russa, dove lavorano studenti e seguaci dell'accademico D. G. Knorre.

È così che la vita stessa ha dimostrato la fecondità dell'idea sorta nel ramo siberiano quarant'anni fa. Utilizzando brevi frammenti di acidi nucleici come strutture di base per creare sostanze biologicamente attive mirate ai geni, è possibile sviluppare rapidamente e introdurre nella produzione farmaci specifici contro quasi tutti i virus. Per fare ciò, è solo necessario decifrare la sequenza nucleotidica dei geni virali, cosa facile da fare con l'aiuto delle moderne tecnologie. Questo approccio universale ha un grande futuro: i risultati di recenti studi, in particolare sulla mutagenesi site-directed, ci consentono di contare sull'emergere nel prossimo futuro di farmaci efficaci per combattere malattie ancora considerate incurabili.

Sommario

La revisione considera le caratteristiche farmacocinetiche di vari preparati di oligonucleotidi antisenso. È stata confrontata la farmacocinetica dei farmaci di prima e seconda generazione. E considerato anche l'effetto sulla farmacocinetica della modifica chimica della molecola.

Parole chiave Parole chiave: oligonucleotidi antisenso, oligodeossinucleotidi di fosfotioato, farmacocinetica

introduzione

Le proprietà farmacocinetiche degli oligonucleotidi antisenso (ASO) vengono meglio comprese se si considerano le loro proprietà fisiche e chimiche. Parametri come carica, peso molecolare e natura anfipatica degli ACO di fosfotioato hanno un marcato effetto sulla loro farmacocinetica. La struttura chimica, in particolare il gruppo fosfotioato e 2'-metossietile (MOE), ha un effetto particolarmente significativo sulle proprietà farmacocinetiche dell'ASO.

L'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l'escrezione degli oligodeossinucleotidi di fosfotioato (ODN) di prima generazione sono stati ampiamente studiati in animali da laboratorio e in studi clinici. Le caratteristiche della farmacocinetica dei preparati di fosfotioato ASO sono le seguenti: l'ODN di fosfotioato somministrato per via parenterale si ritrova rapidamente nel plasma sanguigno, dove si legano alle regioni idrofile delle proteine ​​plasmatiche ed evitano così la filtrazione glomerulare. Queste regioni idrofile sono distinte dalle altre regioni idrofile a cui si legano i farmaci lipofili, e quindi c'è poca competizione per il legame delle proteine ​​plasmatiche per l'ASO. La cinetica del plasma è caratterizzata da una breve fase di distribuzione (dell'ordine di alcune ore) seguita da una fase di eliminazione con un'emivita di giorni o settimane. La fase iniziale di distribuzione comprende necessariamente il legame dell'ASO alle proteine ​​e la distribuzione di questi complessi sui tessuti del fegato, dei reni, dei linfonodi, del midollo osseo e della milza, che sono i siti del legame e dell'accumulo più attivi dell'ASO . È chiaro che la fase di eliminazione dell'ASO dovuta al legame proteico iniziale è determinata dalla fase iniziale della sua distribuzione. A causa della possibile saturazione delle proteine , l'area sotto la curva farmacocinetica (AUC) aumenta con l'aumentare della dose, poiché l'ASO non si lega più alle proteine ​​dopo la loro saturazione, ma entra nel flusso sanguigno in forma libera. Dopo il legame, l'ASO entra nelle cellule lungo un gradiente di concentrazione dallo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare nello spazio intracellulare, probabilmente con l'aiuto di una proteina vettore. Gli ASO nelle cellule si legano ai bersagli disponibili, ma molto probabilmente gli ASO nelle cellule si legano alle proteine ​​intracellulari. Nella cellula, le nucleasi onnipresenti, ma non gli enzimi del citocromo P450, metabolizzano i preparati di ASO. Poiché gli enzimi del citocromo P450 di solito metabolizzano i farmaci a piccole molecole, gli ASO non competono nei processi metabolici con i composti a piccole molecole convenzionali, riducendo il rischio di interazioni farmacologiche. L'escrezione di ASO nelle urine è in definitiva il risultato del metabolismo nei tessuti e dell'instaurazione di un equilibrio di metaboliti e sostanze native al di fuori dei tessuti e nella circolazione sistemica. Questi processi negli animali da laboratorio e nell'uomo sono molto simili, motivo per cui non è possibile identificare una correlazione interspecie tra animali da laboratorio e umani.

Attualmente, la configurazione ASO di "seconda generazione", che presenta gruppi MOE nella posizione 2" dei nucleotidi alle estremità 3" e 5", è più ampiamente utilizzata negli studi clinici. Questa configurazione è una struttura più avanzata rispetto agli ODN di fosfotioato non modificato . , che sono farmaci antisenso di prima generazione.Ciò è dovuto alla sua maggiore efficacia, ridotta tossicità e aumento dell'emivita.Molti fattori associati al passaggio dalla prima alla seconda generazione di ASO sono direttamente correlati al miglioramento della loro farmacocinetica.

Caratteristiche della struttura chimica dell'ASO

Scheletro di fosfotioato

I primi tentativi di creare farmaci con attività antisenso furono associati all'uso di DNA non modificato, che, sfortunatamente, era molto suscettibile alla degradazione da parte della nucleasi. Come si è scoperto, le nucleasi ubiquitarie scindono i legami fosfodiesterasici del DNA nativo, con il risultato che l'emivita degli ASO non modificati è di pochi minuti. Questa rapida degradazione era una caratteristica importante del profilo farmacocinetico dei DNA antisenso non modificati. La modifica della spina dorsale del fosfodiestere del DNA in fosfotioato ha cambiato drasticamente il profilo farmacocinetico dell'ASO. In queste preparazioni, la struttura del fosfotioato sostituisce un atomo di zolfo nei legami fosfodiestere con un atomo di ossigeno non ponte. Questa struttura aumenta la resistenza dell'ASO alle nucleasi e, di conseguenza, ne migliora le proprietà cinetiche.

Chiralità del fosfotio

Gli studi hanno dimostrato che la tiazione dello scheletro del diestere ACO non solo aumenta la sua resistenza alle nucleasi, ma contribuisce anche all'emergere della chiralità, cioè alla possibilità dell'esistenza di stereoisomeri, ad ogni legame fosfotioato, il che porta al fatto che in ogni ACO da 20 mer ci sono 219 stereoisomeri Sp o Rp. La combinazione di resistenza alla nucleasi e aumento del legame proteico influenza fortemente la farmacocinetica dell'ASO. L'aumento della stabilità del fosfotioato ASO porta al fatto che l'emivita del farmaco dal plasma aumenta a 30-60 minuti rispetto all'emivita del fosfodiestere ASO, che è di 1-2 minuti.

Vale la pena discutere della resistenza alla nucleasi e della chiralità dovute alla sostituzione del fosfodiestere con legami fosfotioato perché le proprietà fisiche associate a questa caratteristica strutturale sono importanti sia per gli ASO di prima che di seconda generazione. La resistenza alle nucleasi del fosfotioato ASO deriva dalla vicinanza dello zolfo sull'ossigeno non ponte nel sito attivo dell'esonucleasi allo ione metallico. Questa vicinanza può causare lo spostamento dello ione metallico dal sito attivo. Questo effetto è stato dimostrato nel modello di esonucleasi della DNA polimerasi 3'–5'. I dati cristallografici a raggi X supportano questa ipotesi sullo spostamento dello ione metallico. Le apparenti differenze nella sensibilità degli stereoisomeri all'attività esonucleasica della DNA polimerasi sono coerenti con la conformazione proposta degli stereoisomeri del fosfotioato ODN nel sito attivo. È probabile che la chiralità dei legami fosforotioato possa interferire con altre nucleasi allo stesso modo, cioè mediante spostamento di ioni metallici, sebbene esonucleasi diverse possano mostrare preferenze diverse per i legami Rp e Sp a seconda della natura del sito attivo dell'enzima.

In alternativa, lo zolfo può semplicemente sostituire l'ossigeno nei legami diestere. Le differenze nella capacità dello zolfo di assumere una carica negativa, rispetto all'ossigeno, consentono di prevedere i cambiamenti nel sito attivo. Questo cambiamento è molto probabilmente dovuto all'idrolisi dei legami fosfodiestere e può essere dovuto alla formazione di un fosforo pentavalente transitorio con due atomi di ossigeno caricati negativamente. La sostituzione di uno degli atomi di ossigeno equatoriali con zolfo avrà effetti negativi sull'attività enzimatica: (1) si riduce il legame con l'acqua, che stabilizza la carica negativa locale sugli atomi, rendendo difficile ottenere una seconda carica negativa sullo zolfo; e (2) ridotto legame di Mg 2+ allo zolfo. Ci sono prove di quest'ultimo effetto negli studi sul livello di scissione del ribozima delle inclusioni di fosforotioato diastereomerico, quando l'aggiunta di Mg 2+ inibisce gli effetti di scissione dei ribozimi del fosforotioato. Inoltre, è stato dimostrato che vi è una certa diminuzione dell'attività nucleasica nelle regioni scheletriche più lontane dai legami fosfotioato, suggerendo una trasmissione dell'effetto chiralità. Questo fenomeno è meglio spiegato dai cambiamenti nella disposizione delle molecole d'acqua attorno alla spina dorsale del fosfotioato rispetto alla spina dorsale del fosfodiestere.

Gli effetti stereospecifici sull'attività della nucleasi influenzano significativamente la farmacocinetica degli ASO fosforotioati e questo si manifesta più chiaramente nel tasso di metabolismo degli ASO fosforotioati di prima generazione nel plasma sanguigno. Il tasso di completa eliminazione dell'ASO dal plasma diminuisce, suggerendo un rallentamento del metabolismo. Queste variazioni di velocità non possono essere spiegate in termini di cinetica del primo ordine da sole, ma possono essere spiegate da differenze nella suscettibilità dei legami Rp e Sp.

Le differenze stereospecifiche nell'attività dell'esonucleasi sono meno importanti per gli ASO di seconda generazione. Ciò è dovuto al fatto che gli ASO di seconda generazione hanno modifiche di 2" alle estremità 3" e 5", che ne impediscono la scissione da parte dell'esonucleasi. Con l'aiuto di un'endonucleasi isolata dal patogeno Serratia marcescens, gli effetti della chiralità dei legami fosforotioato, allo stesso modo delle esonucleasi, è uno degli ossigeni non ponte per l'idrolisi dei legami fosfodiestere.Nel diastereomero lo zolfo è localizzato in prossimità del Mg 2+, di conseguenza di cui l'attività dell'enzima diminuisce, mentre nel diastereomero Rp non lo fa.Poiché l'endonucleasi Serratia ha somiglianze significative con alcune endonucleasi di mammiferi, si dovrebbe presumere che questo meccanismo possa essere ampiamente applicabile.Come influenzano le caratteristiche stereochimiche dei legami fosforotioato l'azione di altre endonucleasi non è nota Tuttavia, se assumiamo che la reazione proceda secondo uno schema simile all'endonucleasi di Serratia, possiamo presumere che il sito attivo conterrà e è un metallo (probabilmente Mg 2+) e lo zolfo influenzerà l'azione delle nucleasi , quando è orientato verso lo ione metallico. Se le endonucleasi sono sensibili alla chiralità, ciò potrebbe avere importanti implicazioni per lo sviluppo del problema della creazione di farmaci efficaci di seconda generazione. Oltre all'effetto della chiralità sui farmaci di prima generazione, l'effetto chirale sul metabolismo dei farmaci di seconda generazione può portare a un rallentamento del loro metabolismo. Pertanto, ad esempio, si può presumere che gli stereoisomeri a metabolizzazione rapida vengano distrutti selettivamente, lasciando funzionanti solo gli isomeri metabolizzati lentamente.

ASO legante alle proteine

È stato riscontrato che, rispetto all'ASO con uno scheletro di fosfodiestere, la farmacocinetica delle strutture di fosfotioato è significativamente influenzata dal loro legame con le proteine. La base chimica per un maggiore legame con le proteine ​​è la maggiore lipofilia dei legami fosfotioato rispetto ai legami fosfodiestere. Poiché le interazioni molecolari con l'acqua sono determinate dalla forma e dalla funzione delle macromolecole in soluzione acquosa, anche piccoli cambiamenti nella lipofilia scheletrica lungo l'intera lunghezza dell'ASO possono avere conseguenze per l'interazione dell'oligomero con l'acqua e macromolecole come le proteine.

In prima approssimazione, gli ODN di fosfotioato si legano alle proteine ​​cellulari in modo più casuale rispetto agli ODN di fosfodiestere. Il motivo per cui gli ASO di fosfotioato si legano meglio alle proteine ​​non è del tutto chiaro. Possibili spiegazioni suggeriscono una maggiore lipofilia e complessazione con ioni metallici.

L'importanza del legame con le proteine ​​plasmatiche per la farmacologia, la farmacocinetica e la tossicologia degli ASO di fosfotioato (sia di prima che di seconda generazione) non può essere sopravvalutata. A livello di concentrazione micromolare, oltre il 90% degli ODN di fosfotioato è legato al plasma. Esistono differenze specifiche nella percentuale e nella forza del legame proteico, nonché differenze qualitative nel legame dell'ASO a proteine ​​​​specifiche in specie diverse. Il legame del fosfotioato ASO alle proteine ​​circolanti impedisce a questi composti di essere filtrati dai glomeruli renali ed escreti nelle urine. In caso di saturazione, ad esempio, quando viene somministrata una grande dose di ASO, viene potenziata l'escrezione urinaria di ASO a lunghezza intera. A causa delle differenze di specie, la saturazione nelle diverse specie è determinata da diverse concentrazioni di ASO. Ad esempio, le proteine ​​plasmatiche del topo hanno un'affinità inferiore per l'ASO rispetto a quelle dei ratti o dell'uomo. Pertanto, l'effetto della saturazione del processo di legame dell'ASO alle proteine ​​plasmatiche nei topi si verifica a concentrazioni inferiori rispetto ad altre specie. Le differenze di specie nel legame con le proteine ​​plasmatiche sono un fattore significativo nelle differenze nella farmacocinetica interspecie.

Anche la resistenza alla nucleasi e il legame proteico, che sono caratteristici dell'ASO con legami fosfotioato, alterano la farmacocinetica della terapia con ASO. Ulteriori strutture chimiche, caratteristiche della seconda generazione di farmaci creati, introducono altri cambiamenti nella loro farmacocinetica.

Derivati ​​metossietilici dell'ACO

Gli ASO di seconda generazione sono stati sviluppati per migliorare alcune delle caratteristiche degli ODN di prima generazione. Pertanto, le strutture di fosfotioato aggiunte ai gruppi MOE nelle posizioni 2" aumentano la loro resistenza alle nucleasi e cambiano l'efficienza del legame proteico.

MOE resistenza alle nucleasi

È stato dimostrato che la struttura del MOE influisce sulla resistenza dell'ASO alle nucleasi. Mentre le strutture di fosfotioato riducono l'attività dell'esonucleasi, la struttura nella posizione 2" elimina virtualmente l'attività dell'esonucleasi. La resistenza alla nucleasi può essere il risultato di (1) sostituzione dell'idrogeno da 2" per MOE, (2) effetti sterici di MOE o (3) formazione di un guscio d'acqua rigido attorno allo scheletro ASO. Qualunque siano le ragioni della resistenza alle nucleasi, la presenza del gruppo MOE rende gli ASO alterati nella posizione 2" praticamente immuni agli effetti delle nucleasi circolanti e della maggior parte delle nucleasi cellulari. La regione centrale dello scheletro dell'ASO, costituita da deossifosfotioati, non è così resistente alle scissioni mediate da nucleasi.Le differenze di ASO della prima e della seconda generazione nei siti soggetti a metabolismo determinano anche le differenze nei modelli metabolici.

Durante la valutazione dei modelli metabolici mediante elettroforesi su gel capillare (CGE) o cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS), non sono stati trovati metaboliti più corti di un nucleotide. Soprattutto, sono stati trovati metaboliti scissi nel sito deossi (presumibilmente da endonucleasi), l'ulteriore via del metabolismo è ridurre le dimensioni dei prodotti di scissione. La resistenza all'esonucleasi e il lento metabolismo sotto l'influenza delle endonucleasi attive portano alla formazione di composti caratterizzati da una lunga emivita .

Legame di MOE alle proteine

Studi sperimentali hanno dimostrato che gli ASO di fosfotioato con strutture 2'-MOE hanno un'affinità inferiore per le proteine ​​plasmatiche rispetto agli ASO di fosfotioato non modificati, da circa 18 a circa 40 μM. Allo stesso tempo, nella struttura MOE completamente sostituita dell'ASO, l'affinità per le proteine ​​plasmatiche diminuisce solo leggermente. Non è chiaro perché un aumento del numero di strutture MOE in un oligonucleotide non influisca su un'ulteriore diminuzione dell'affinità per le proteine ​​plasmatiche, ma ciò potrebbe essere dovuto alle caratteristiche della struttura secondaria dell'ASO.

La diminuzione dell'affinità proteica associata alle strutture MOE può essere giustificata da alcune proprietà fisiche. Probabilmente il fattore fisico più significativo che distingue gli ASO MOE modificati da quelli non modificati è la presenza di un guscio molecolare d'acqua, che nasce dalla catena laterale MOE. I sostituenti MOE nella spina dorsale degli idrocarburi "chelano" le molecole d'acqua (e possibilmente ioni metallici), formando un guscio acquoso e riducendo il potenziale contatto tra le molecole di zolfo "appiccicose" e le proteine ​​plasmatiche o cellulari. Il grado di legame dell'ASO alle proteine ​​è inversamente correlato alla loro escrezione nelle urine. L'introduzione di legami fosfotioato e sostituenti 2'-MOE altera il legame proteico e, di conseguenza, altera le proprietà dell'ASO.

Assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione di ASO

Aspirazione

Via parenterale di somministrazione di ASO

Gli studi hanno stabilito che a causa del peso molecolare (circa 7000 D) e delle cariche negative dell'ASO, l'assorbimento di questi farmaci dal tratto gastrointestinale è limitato. Questo è il motivo per cui viene solitamente utilizzata la via parenterale della loro somministrazione. L'infusione sottocutanea, endovenosa o l'iniezione intravitreale viene utilizzata per somministrare farmaci di prima generazione. La minore attività pro-infiammatoria degli ASO di seconda generazione li rende più adatti alla somministrazione sottocutanea. La farmacocinetica di questi farmaci nel plasma con iniezioni sottocutanee e infusioni endovenose è comparabile. Studi su animali da laboratorio mostrano che, in definitiva, anche la distribuzione dell'ASO è comparabile tra vari organi, ad eccezione del sito di iniezione e dei linfonodi.

Dopo somministrazione sottocutanea, gli ASO di prima e seconda generazione vengono rapidamente assorbiti dal sito di iniezione nella circolazione sistemica. Negli studi clinici, dopo somministrazione sottocutanea di ASO di seconda generazione, il tempo per raggiungere la concentrazione massima (T max) varia da 1,5 a 4,7 ore nell'intervallo di dose da 25 a 200 mg a un volume costante di 1 ml. La biodisponibilità della dose sottocutanea varia dal 36 all'82% della dose somministrata. Studi preclinici e clinici suggeriscono che la biodisponibilità dell'ASO aumenta con la concentrazione.

La cinetica degli ASO nel sito di iniezione può influenzare la risposta locale, nonché la loro cinetica e distribuzione sistemiche. La riduzione della concentrazione di ASO nel sito di iniezione riduce ipoteticamente la risposta locale all'iniezione. Un approccio per ridurre la concentrazione di ASO nel sito di iniezione consiste nel diluire la soluzione e, di conseguenza, aumentare la superficie di assorbimento dal deposito sottocutaneo. Teoricamente, la diluizione delle soluzioni e l'ampia superficie di aspirazione dovrebbero ridurre la concentrazione locale e ridurre le reazioni locali. Gli stessi effetti potrebbero essere previsti con un aumento dell'assorbimento sistemico. Pertanto, le variazioni di dose e volume possono essere considerate variabili potenziali. Tuttavia, ancora oggi, le iniezioni sottocutanee con bassi volumi e concentrazioni relativamente elevate dimostrano un'elevata biodisponibilità del materiale applicato.

Amministrazione locale dell'ASO

Uno studio di vari metodi di somministrazione di ASO dimostra che le loro forme di aerosol, la somministrazione rettale e le iniezioni intravitreali sono utilizzate come mezzi di somministrazione locale. Per il trattamento delle malattie polmonari, è possibile creare concentrazioni relativamente elevate di ASO nei polmoni utilizzando aerosol.

La cinetica dell'ODN di prima generazione è stata studiata nei topi. È stato stabilito che la cinetica di tali farmaci è dose-dipendente, la clearance è polmonare con un'emivita di circa 2 ore. Al contrario, gli studi sugli ASO MOE modificati di seconda generazione mostrano un'emivita di oltre 4 giorni. Come per altri trattamenti topici, il vantaggio dell'inalazione è la capacità di creare elevate concentrazioni locali nei tessuti che normalmente non accumulano le sostanze applicate. Nei polmoni, l'ASO di solito non si accumula dopo la somministrazione parenterale. Anche l'amministrazione locale raramente provoca effetti sistemici. Ad esempio, quando l'ASO è stato somministrato alle scimmie a una dose di 0,1 mg/kg per inalazione (tre dosi in 1 settimana), la concentrazione del farmaco nei polmoni era di circa 1 μg/g. Ma in queste stesse scimmie, la concentrazione nel fegato e nei reni era circa il 5% della concentrazione nei polmoni, indicando un effetto sistemico significativamente inferiore.

I dati della letteratura indicano che la somministrazione rettale di ASO viene utilizzata con successo per il trattamento della colite ulcerosa. Contrariamente alle inalazioni, dove possono essere utilizzate piccole quantità della sostanza iniettata, il clistere utilizzato per il trattamento può contenere fino a 240 mg della sostanza (alicaforsen) di prima generazione. In questo caso, l'epitelio rettale è esposto alla sostanza iniettata, tuttavia, a causa della scarsa permeabilità degli ODN altamente carichi, vi è un assorbimento minimo del farmaco, nonché un effetto sistemico generale. I calcoli mostrano che la concentrazione di ASO nell'epitelio intestinale 12 ore dopo la somministrazione è di 20 µg/g. La biodisponibilità nell'uomo varia dallo 0,03 al 2,14% e la concentrazione massima di ASO determinata nel plasma è solo 0,126 µg/ml. L'assenza di un significativo assorbimento sistemico e l'elevata concentrazione locale del farmaco hanno un effetto positivo sul trattamento.

È stato condotto uno studio sulle iniezioni intravitreali di preparati ASO sia di prima che di seconda generazione. In questo caso, le sostanze vengono iniettate nell'occhio in quantità molto piccole. A causa dell'isolamento del sito di iniezione, gli effetti sistemici del farmaco sono ridotti in misura ancora maggiore. Nell'occhio, nel corpo vitreo e nella retina, l'ASO entra a velocità diverse: entra nel corpo vitreo più velocemente rispetto alla retina. Sia il metabolismo locale che la diffusione dall'occhio contribuiscono all'eliminazione del farmaco. Come già notato, a causa delle piccole quantità, l'effetto sistemico del farmaco somministrato è minimo. Tuttavia, il meccanismo di distribuzione sistemica è simile alla maggior parte degli altri farmaci.

Somministrazione enterale di ASO

La nota stabilità dell'ASO di seconda generazione alle nucleasi garantisce la stabilità del farmaco nell'intestino, il che rende possibile un ulteriore assorbimento. Tuttavia, le dimensioni della molecola e le cariche di ACO limitano l'assorbimento del farmaco. Dopo l'assorbimento dall'intestino, la cinetica dell'ASO è simile a quella della sua somministrazione parenterale. Sebbene il fegato sia uno dei principali siti di accumulo di ASO, l'effetto di primo passaggio attraverso il fegato non è un fattore importante che influenza la cinetica del farmaco ASO.

Distribuzione di ASO nel corpo

Il ruolo della perfusione e dell'affinità tissutale

La distribuzione dell'ASO e di altri farmaci dipende dalla permeabilità, dall'intensità dell'afflusso di sangue, dal legame con le proteine ​​plasmatiche, i tessuti e le cellule. È stato dimostrato che la distribuzione degli ASO di fosfotioato di prima e seconda generazione nei tessuti con le loro molteplici cariche negative e il loro legame con le proteine ​​dipende meno dall'afflusso di sangue e molto più dai fattori che influenzano il loro trasporto nella cellula.

La distribuzione interna dal plasma ai tessuti è relativamente veloce, l'emivita di eliminazione è di 30-90 minuti dopo la somministrazione endovenosa. L'emivita dell'ASO dopo somministrazione sottocutanea è più lunga che dopo somministrazione endovenosa. Questa differenza è dovuta al tempo necessario per l'assorbimento e non ad altre differenze nella farmacocinetica.

Lo studio della cinetica dei farmaci di prima e seconda generazione ha rilevato le sue lievi differenze. Una maggiore stabilità alle nucleasi ASO di seconda generazione è compensata dal loro minore legame con le proteine. Insieme a questo, i profili farmacocinetici dei farmaci di 1a e 2a generazione sono simili o quasi indistinguibili quando la somma dell'ASO nativo e dei suoi metaboliti (ASO totale) della prima generazione viene confrontata con il farmaco intatto di seconda generazione (ISIS 13650). Altrimenti, una più rapida distruzione dell'ASO da parte delle esonucleasi ridurrebbe l'emivita dei farmaci di prima generazione rispetto a quelli di seconda generazione. La distribuzione dei farmaci di entrambe le generazioni è dose-dipendente.

Come notato sopra, dopo l'assorbimento dal sito di iniezione o dall'intestino, gli ASO si legano alle proteine ​​plasmatiche. Due proteine ​​plasmatiche che si legano specificamente agli ASO del fosfotioato sono l'albumina e l'alfa-2-macroglobulina. Un'altra proteina comune, la glicoproteina acida, non si lega all'ASO. Il legame proteico è molto importante per la distribuzione di ASO nel tessuto bersaglio. Le strutture chimiche che riducono il legame portano a una marcata diminuzione della concentrazione del farmaco nei tessuti, aumentano il grado della sua filtrazione attraverso i glomeruli renali e l'escrezione nelle urine. Questo fenomeno può essere osservato quando si utilizza ASO con legami diesteri nello scheletro del preparato o in presenza della struttura MOE. Una diminuzione dell'affinità dei diesteri e delle strutture MOE (o di entrambi) per le proteine ​​consente all'ASO di circolare più liberamente nel flusso sanguigno, portando a un'intensificazione della sua escrezione nelle urine.

In tutti gli studi con ASO parenterali di prima e seconda generazione, non abbiamo osservato una clearance lineare degli ASO dal plasma. La clearance diminuiva con l'aumentare della dose del farmaco e, pertanto, la sua biodisponibilità era maggiore di quanto ci si aspetterebbe dalla dose somministrata. Poiché la clearance iniziale è dovuta alla distribuzione di ASO nei tessuti e, allo stesso tempo, è stato osservato l'assorbimento del farmaco da parte dei tessuti, si può ipotizzare la possibilità di una loro saturazione con ASO. Lo studio del processo di saturazione a seguito dell'introduzione di ASO può essere effettuato utilizzando i fagociti del fegato. Quando il legame di ASO alle cellule di Kupffer raggiunge la saturazione, inizierà una diminuzione dell'affinità. La successiva somministrazione di ASO ai topi migliora la distribuzione di ASO alle cellule epatiche non fagocitiche e, di conseguenza, l'attività farmacologica negli epatociti è migliorata rispetto al controllo. Al contrario, a concentrazioni plasmatiche inferiori a 1 µg/ml, l'ASO si lega più attivamente alle cellule di Kupffer e si accumula meno negli epatociti.

Lo studio del processo di legame dell'ASO alle proteine ​​plasmatiche ha mostrato che questo effetto è accompagnato da una rapida distribuzione del complesso nei tessuti sulla superficie cellulare. Sebbene i meccanismi esatti del legame cellulare non siano stati stabiliti, si può presumere che gli ASO si leghino alle proteine ​​plasmatiche o alle proteine ​​cellulari purché vi siano siti di legame liberi. Gli ASO legati vengono quindi distribuiti lungo il gradiente di concentrazione attraverso la membrana cellulare scambiando una proteina extracellulare con una intracellulare.

Pertanto, la forza trainante dell'ingresso di ASO nelle cellule è il gradiente di concentrazione. È stato descritto il movimento navetta dell'ASO tra il citoplasma e il nucleo. In generale, è chiaro che il legame proteico facilita il movimento di ACO attraverso barriere che normalmente inibiscono il movimento di molecole idrofile altamente cariche. Questo meccanismo della navetta di membrana rimane un'ipotesi per l'ASO, ma è stato precedentemente descritto per i composti organometallici. Il trasporto di ASO dalla matrice extracellulare allo spazio intracellulare è stato visualizzato nel fegato di topi mediante metodi immunoistochimici e nei reni di ratti mediante microscopia vitale con un'etichetta fluorescente per ASO di seconda generazione (S. Henry, B. Molitoris).

L'identità delle proteine ​​che controllano il trasporto di ASO dallo spazio extracellulare a quello intracellulare non è nota, ma si ritiene che il legame del complesso proteina-ASO alla cellula avvenga utilizzando il recettore fagocitario. Poiché i fagociti, come le cellule di Kupffer, i macrofagi tissutali e le cellule dei tubuli prossimali, hanno un'elevata affinità per l'ASO, si può pensare alla possibilità di trovare tali recettori sulla loro superficie cellulare.

Tuttavia, la distribuzione cellulare e la farmacodinamica dell'ASO nei topi transgenici privi del recettore fagocitico SR-A I/II non differivano da quelle degli animali singenici di controllo. Pertanto, questo recettore, noto come recettore Scavenger, non sembra essere responsabile dell'assorbimento del complesso da parte del fegato e dei reni. Il ruolo di altre strutture accettori coinvolte nei processi di endocitosi del complesso ACO-proteina non è stato studiato.

Proteine ​​di membrana che fungono da vettori , sono presenti in tutti gli organismi. I principali vettori di farmaci sono: ABC ( trasportatori di cassette di legame ATP) e SLC (famiglia di portatori di soluti). È noto che la velocità di trasferimento di sostanze attraverso membrane biologiche mediante processi mediati da trasportatori è caratterizzata da saturazione. Vengono descritti diversi membri della famiglia SLC con caratteristiche note , principalmente per il trasporto di nucleosidi, zuccheri nucleosidici e zuccheri fosfati. Si ritiene che gli studi futuri riguarderanno molto probabilmente i processi di trasporto intermembrana ASO.

È chiaro che, oltre alle suddette differenze nell'accumulo di strutture create da diversi organi e tessuti e alla dipendenza della clearance e distribuzione di tali composti dalla loro dose, la distribuzione dell'ASO nei tessuti è influenzata dai sistemi di trasporto, il caratteristiche del flusso sanguigno degli individui, il possibile tempo di permanenza del farmaco nell'organismo e, infine, la saturazione dei tessuti con ASO. Nonostante il ruolo significativo di questi fattori nei processi di distribuzione tissutale dell'ASO, si ritiene che il legame iniziale dell'ASO alla superficie cellulare sia uno dei fattori determinanti nei meccanismi analizzati. Questa conclusione si basa sul fatto che il fegato ei reni sono i siti iniziali di legame dell'ASO con un accumulo aggiuntivo nelle prime 24 ore dopo la somministrazione di ASO. Durante lo studio dei parametri di distribuzione dell'ASO nel fegato e nei reni, è stato mostrato un aumento frazionario della concentrazione del farmaco negli organi durante le prime 24 ore. Ciò si verifica durante un periodo di ridistribuzione cellulare e subcellulare dell'ASO, ma presumibilmente gli organi di distribuzione primari dovrebbero accumulare più materiale nel tempo a causa della maggiore affinità di questi organi per l'ASO. Le proteine ​​responsabili di questa affinità possono contenere siti di legame simili all'eparina per laminina e fibrinogeno e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). L'interazione precoce dell'ASO con la cellula può essere dovuta al legame di queste proteine, ma la natura di queste proteine, come notato sopra, è stata poco studiata.

Considerando il significato della combinazione di specifici siti di legame dell'ASO con le cellule nella distribuzione del farmaco nel corpo, si dovrebbe anche notare un fattore così importante come il diverso afflusso di sangue ai diversi organi, la cui possibilità di influenzare la diversa distribuzione del fosfotioato ASO è ovvio. Secondo vari autori, il lavoro con dozzine di serie di sostanze sia della prima che della seconda generazione indica la loro distribuzione simile e una distribuzione notevolmente simile in individui di specie diverse. Reni, fegato, linfonodi, milza e midollo osseo sono gli organi che accumulano la maggior quantità di ASO e dei loro metaboliti. Il fatto che i polmoni e il cuore non accumulino ASO indica che il pronunciato accumulo di ASO nel fegato e nei reni non è sufficiente a spiegare da solo il loro buon apporto di sangue. Ad esempio, le aree con la migliore circolazione sanguigna nei reni sono i glomeruli e non sono le aree che contengono più ASO. Al contrario, nei tubuli prossimali la circolazione sanguigna è meno attiva. Tuttavia, le cellule dei tubuli prossimali sono caratterizzate da un gran numero di cellule fagocitiche attive, accumulano ASO liberi, nonché ASO associati a proteine ​​​​che di solito vengono riassorbite nei tubuli prossimali. Di conseguenza, la corteccia renale e l'epitelio tubulare prossimale contengono la più alta concentrazione di ASO di fosfotioato, sia di prima che di seconda generazione.

Va anche notato che l'apporto di sangue (ml/g di tessuto) del fegato è circa il 20% di quello dei reni. Differenze di 4-5 volte nella perfusione tra i reni e il fegato non portano a differenze di 4-5 volte nella concentrazione di ASO in questi organi. I capillari fenestrati aumentano l'area di contatto tra l'ASO e il flusso sanguigno e, quindi, questo può compensare l'insufficiente perfusione del fegato rispetto ai reni.

ASO che si lega alle proteine ​​plasmatiche durante la distribuzione

Sebbene la saturazione delle cellule con ASO alla fine influisca sulla loro distribuzione negli organi, il legame dell'ASO alle proteine ​​plasmatiche può modificare la distribuzione nei reni e nel fegato in diverse serie. Ci sono differenze seriali nel legame proteico. Con una diminuzione del legame dell'ASO alle proteine ​​plasmatiche, il loro accumulo nel fegato diminuisce e aumenta il loro accumulo nei reni. Al contrario, con un legame più elevato, la concentrazione di ASO nella forma libera nel flusso sanguigno sarà in quantità minore, si accumulerà meno nei reni e di più negli altri organi. Esiste una relazione inversa tra il grado di legame dell'ASO alle proteine ​​e il loro accumulo nei reni di ratti e scimmie dopo ripetute somministrazioni per via endovenosa e sottocutanea.

Il legame proteico può essere utilizzato come criterio di selezione per l'ASO per gli studi clinici. Ad oggi, la determinazione del legame proteico è un processo empirico senza alcun modo per prevedere quali serie si legheranno più o meno alle proteine.

Distribuzione di ASO ad altri organi

Indipendentemente dalla sequenza di distribuzione degli ASO di fosfotioato di prima e seconda generazione, si osserva un modello caratteristico di localizzazione di questi farmaci nei reni e nel fegato, nonché nella milza e nei linfonodi, nelle ossa e nel citoplasma degli adipociti. L'accumulo di ASO nel tessuto linfoide può essere spiegato in parte dall'attività fagocitica degli istiociti e di altre cellule mononucleate. È possibile visualizzare l'ASO nei fagolisosomi degli istiociti e nei tessuti dei macrofagi usando la colorazione dell'ematossilina. È stato dimostrato che gli ASO subiscono endocitosi, si localizzano negli endosomi e rimangono all'interno di queste strutture. La concentrazione di ASO nei fagolisosomi è spesso tale da poter essere determinata mediante colorazione con ematossilina (quasi come il DNA nucleare). L'ASO nei fagolisosomi costituisce probabilmente la maggior parte dell'ASO accumulato nella milza e negli organi linfoidi. Inoltre, le cellule fagocitiche delle ossa e del midollo osseo accumulano ASO in questi tessuti, il che è confermato dalla presenza di granuli basofili nelle loro cellule.

I muscoli (sia scheletrici che cardiaci) non contengono quantità significative di ASO. Tuttavia, un attento esame dei muscoli mediante metodi immunoistochimici o autoradiografici rivela il contenuto di ASO nei fagolisosomi dei macrofagi dello stroma muscolare e questo accumulo può influenzare parzialmente la misurazione della concentrazione di ASO nei muscoli e nel cuore.

L'accumulo di ASO nel citoplasma degli adipociti è significativo dal punto di vista terapeutico. Soprattutto perché, a differenza della maggior parte delle sostanze accumulate negli adipociti, gli ASO sono idrofili. I metodi immunoistochimici mostrano chiaramente che l'ASO si trova nella frazione citoplasmatica degli adipociti, mentre l'ASO è quasi assente nel vacuolo grasso. L'intensità della colorazione indica un significativo accumulo della sostanza nel citoplasma. Ad esempio, nelle scimmie dopo 13 settimane di trattamento con ISIS 113715 alla dose di 10 mg/kg/settimana, la concentrazione nel fegato era di 301 ± 88,1 μg/g, ma solo 37,3 ± 14,4 μg/g nel tessuto adiposo nel stessi animali.

Considerando che la componente non grassa è il 10% della massa grassa totale, la correzione della concentrazione di ASO, tenendo conto di questo indicatore, indica la comparabilità della sua concentrazione con quella nel fegato. Concentrazioni significative di ASO negli adipociti indicano che possono essere utilizzate per curare malattie genetiche di questo tipo cellulare: fonti di ormoni e citochine. Pertanto, è stato riscontrato che le concentrazioni farmacologicamente attive di ASO sono registrate negli adipociti dei topi quando ISIS 113715 viene somministrato alla dose di 25 mg/kg due volte a settimana e riduce l'espressione del gene bersaglio PTP-1B sia nel fegato che nel adipociti. Osservazioni simili sono state fatte in scimmie trattate con ASO ISIS 113715. Poiché la biopsia del grasso sottocutaneo può essere eseguita clinicamente e poiché l'ASO attivo si accumula nel grasso, il grasso può essere utilizzato per la biopsia e misurare direttamente gli effetti farmacologici (riduzione dell'mRNA) e la concentrazione tissutale del farmaco in tessuti umani.

Gli ASO di fosfotioato sono distribuiti anche ad altri tessuti. Studi immunoistochimici mostrano che le cellule endoteliali accumulano ASO a concentrazioni sufficienti per ridurre i livelli di mRNA, rendendole un potenziale bersaglio per l'intervento farmacologico. In alcuni tessuti, le loro concentrazioni non sono sufficientemente elevate per un effetto farmacologico. Ad esempio, i linfociti maturi non accumulano ASO e l'attività antisenso è limitata dai linfociti T.

Le cellule ossee, in particolare gli osteoblasti fagociticamente attivi, possono accumulare ASO e questo effetto può essere utilizzato per scopi terapeutici. Inoltre, anche le cellule delle isole pancreatiche accumulano ASO. Sia la prima che la seconda generazione di ASO sono molecole idrofile altamente cariche che non attraversano le barriere emato-encefaliche o emato-testicolari. Tuttavia, come nei muscoli, i macrofagi contenenti ASO rilevabili sono localizzati nella regione interstiziale dei testicoli. Le ovaie non sono separate da una barriera, quindi l'ASO può essere misurato quantitativamente nelle ovaie e visualizzato mediante immunoistochimica nello stroma.

La distribuzione limitata dell'ASO plasmatico alle cellule cerebrali e ai cardiomiociti rende questi tessuti improbabili bersagli per l'interferenza antisenso, sebbene l'inibizione selettiva o l'espressione di alcune proteine ​​​​del canale ionico nel cervello e nei muscoli possano essere terapeuticamente benefiche. Tuttavia, la distribuzione limitata di ASO in questi tessuti può essere vista come un vantaggio. L'assenza di concentrazioni significative di ASO nel cervello e nel cuore riduce il rischio di danni al sistema nervoso centrale (SNC) e riduce la manifestazione di effetti cardiaci indesiderati. Come notato in precedenza, la somministrazione diretta alle strutture del SNC, in particolare al cervello, mediante infusione o iniezione intratecale, intraventricolare provoca la distribuzione di ASO all'interno del sistema nervoso centrale e può essere utile terapeuticamente.

Durante la gravidanza, il feto è abbastanza ben protetto dagli effetti dei farmaci antisenso. Lo studio della cinetica transplacentare dell'ASO non ha rivelato il suo accumulo nel feto; è stato notato un basso livello di ASO nei roditori nella placenta. Questi risultati sono stati costantemente replicati in uno studio di teratogenicità di vari ASO di seconda generazione in topi, ratti e conigli. La placenta, nonostante sia altamente perfusa, non è un organo con un elevato accumulo di ASO.

In generale, i fatti presentati mostrano che la distribuzione dell'ASO è uno dei fattori chiave che determina la gravità dell'attività dell'ASO. Le differenze nella distribuzione dell'ASO sembrano essere legate in gran parte al trofismo tissutale di questi farmaci e, in misura minore, alla perfusione.

Metabolismo

I farmaci antisenso di prima e seconda generazione sono metabolizzati dalle nucleasi e non dai sistemi ossidasi di tipo citocromo P450, che vengono utilizzati per metabolizzare i farmaci lipofili convenzionali a piccole molecole. L'ASO non è né un substrato per gli isoenzimi del citocromo P450, né induce o inibisce la sua attività a concentrazioni clinicamente significative. La scissione dell'ASO mediata dall'esonucleasi, che è la via principale per il metabolismo e la clearance degli ODN di fosfotioato di prima generazione, è secondaria all'ASO di seconda generazione. L'attività esonucleasica è limitata da due frammenti: un MOE all'estremità 3' e un altro MOE all'estremità 5'.

Enzimi responsabili del metabolismo dell'ASO

Non sono noti enzimi specifici che metabolizzano ASO di seconda generazione. Le nucleasi sono onnipresenti ed è possibile rilevare metaboliti ASO degradati nella maggior parte dei tessuti. Gli omogenati epatici e renali sono entrambi in grado di metabolizzare l'ASO di seconda generazione in vitro senza l'aggiunta di fonti di energia esogene come la nicotinamide adenin dinucleotide fosfato (NADPH) o l'adenosina 5-trifosfato (ATP). La scissione iniziale si traduce in due prodotti, ciascuno caratterizzato da un'estremità protetta da 5" e 3" MOE. Questi metaboliti non si legano alle proteine ​​e vengono quindi escreti dai tessuti. Poiché i metaboliti vengono rimossi più velocemente di quanto si formino, non vi è praticamente alcun accumulo di metaboliti nei tessuti. Pertanto, non è possibile utilizzare la determinazione della quantità di metaboliti nei tessuti come indice del metabolismo dell'ASO nei tessuti.

Poiché la velocità di eliminazione dell'ASO dai tessuti dipende dal loro metabolismo, le differenze nel metabolismo dell'ASO nei diversi tessuti possono essere stimate in base all'emivita di questi farmaci dai tessuti caratterizzati. Sulla base dei dati per quattro ASO di seconda generazione, si conclude che il comportamento dei membri di questa classe è simile, ma ci sono lievi differenze nella loro emivita rispetto al fegato e ai reni delle scimmie trattate con il farmaco per 4-13 settimane . È stato dimostrato che l'emivita delle preparazioni ACO ISIS 104838 e 112989 dal fegato e dai reni è molto simile. Questi dati suggeriscono che per alcune serie di ASO non ci sono differenze significative nel tasso metabolico nei diversi organi. Tuttavia, sono state identificate differenze nell'emivita dei tessuti per ISIS 107248, 113715 e 301012. Le differenze osservate nel tasso di metabolismo dei farmaci ASO nel fegato e nei reni indicano che potrebbero esserci differenze nel tasso di metabolismo nei diversi tessuti o cinetiche più complesse per alcune serie di prodotti o risultati riflettono semplicemente un numero ridotto di campioni prelevati in un arco di tempo limitato.

Uno studio dettagliato del processo di escrezione di ASO di seconda generazione mostra la presenza di diverse velocità della loro escrezione da diversi tipi di cellule epatiche. Poiché alcuni tipi cellulari, come le cellule tubulari prossimali della corteccia renale, tendono a contenere ASO nei fagolisosomi, questo tipo di assorbimento probabilmente spiega le differenze nei tassi metabolici dei farmaci nei diversi tessuti. Inoltre, è probabile che sequenze specifiche nella struttura dello scheletro ASO possano essere caratterizzate da una diversa sensibilità alla scissione da parte delle endonucleasi.

Le esonucleasi batteriche mostrano un alto grado di specificità per la sequenza nucleotidica nella spina dorsale ASO, presumibilmente per la protezione contro i virus. La maggior parte dell'attività delle nucleasi nelle cellule dei mammiferi è associata ai meccanismi di trascrizione e riparazione del DNA, e quindi la specificità delle specie dei mammiferi può differire da quella delle endonucleasi batteriche. Non è noto se i processi di replicazione e l'azione degli enzimi associati al fenomeno della riparazione siano ugualmente responsabili del catabolismo di questi ASO sintetici. Ad alte concentrazioni di ssDNA, gli ASO possono competere efficacemente con il substrato naturale. Molti enzimi della famiglia delle nucleasi sono in grado di catabolizzare l'ASO. La determinazione degli enzimi specifici coinvolti nel metabolismo dell'ASO non è fondamentale per lo sviluppo di farmaci antisenso, ma una migliore comprensione delle vie metaboliche sarà utile per lo sviluppo di nuove tecnologie.

Metaboliti ASO

Le differenze nel metabolismo degli ASO di prima e seconda generazione sono abbastanza evidenti quando si confronta il profilo metabolico con il CGE. Quando i campioni di tessuto o urina vengono analizzati in un rivelatore LC/MS, la natura dei processi metabolici diventa più chiara. Di norma, gli ODN di fosforotioato di prima generazione vengono metabolizzati in una cascata di metaboliti ASO, ciascuno dei quali differisce di un nucleotide a causa della scissione di un singolo nucleotide da parte dell'esonucleasi. Quindi, dopo l'introduzione di un 20-mer, cioè costituito da 20 nucleotidi, gli ODN di prima generazione, plasma e tessuti contengono famiglie di ASO abbreviate consecutivamente, a partire da 19-mer e oltre fino a un ASO breve.

Scissione iniziale nel metabolismo dell'ASO di seconda generazione mediata da
endonucleasi, porta alla formazione di due ASO, uno con l'estremità 3' del MOE e l'altro con l'estremità 5' del MOE. La scissione di prodotti con estremità non protette può essere effettuata mediante 5'-esonucleasi o 3'-esonucleasi. I risultati dell'attività combinata di endo ed esonucleasi sono una cascata di prodotti di scissione abbreviati a catena, molti dei quali, se non tutti, possono essere rilevati nelle urine raccolte da animali o esseri umani. L'urina degli animali trattati o dei pazienti trattati con ASO di seconda generazione può contenere metaboliti che vanno da due possibili MOE da 15 mer a due possibili MOE da 5 mer e combinazioni multiple di ciascuno dei metaboliti intermedi.

I metaboliti più corti della lunghezza delle estremità del MOE saranno presenti nei tessuti se le estremità del MOE sono esse stesse substrati per le nucleasi. Questi metaboliti di solito non vengono rilevati dall'analisi dello spettro di massa, suggerendo che, di regola, non ci sono mononucleotidi MOE rilasciati durante il metabolismo. Tuttavia, ci sono alcune eccezioni a questa generalizzazione. Per un numero limitato di sequenze nucleotidiche , trim di singolo nucleotide ASO di seconda generazione osservati nei tessuti e nel plasma – CGE o LC/MS: i metaboliti sembrano essere il risultato della digestione con esonucleasi. Questi metaboliti possono essere osservati nella distribuzione iniziale. Si presume che appaiano rapidamente nel plasma sanguigno. I mononucleotidi MOE, che si formano durante il metabolismo, non sono substrati per la fosforilazione, e quindi è improbabile che siano inclusi nei nucleotidi trifosfati e, in definitiva, nei nucleotidi endogeni. I mononucleotidi MOE non inibiscono gli enzimi responsabili della sintesi del DNA. Pertanto, i mononucleotidi MOE, se formati, non dovrebbero essere incorporati nei nucleotidi endogeni.

La parte centrale dei deossinucleotidi della seconda generazione di ASO è soggetta alla scissione dell'esonucleasi, che porta al rilascio di un nucleotide. I monodeossinucleotidi, che sono prodotti dalla scissione dell'esonucleasi, sono identici ai nucleotidi endogeni, ad eccezione del gruppo tiofosfato, che potrebbe teoricamente essere presente. Tuttavia, il gruppo tiofosfato è labile all'ossidazione e alla perdita di zolfo, il che rende il gruppo fosfato terminale identico ai nucleotidi endogeni. Pertanto, a differenza dei mononucleotidi MOE, qualsiasi deossinucleotide rilasciato sarà naturalmente incluso nel deposito intracellulare di nucleotidi endogeni. I nucleotidi che trattengono i gruppi tiofosfato saranno substrati per l'aggiunta di uno o due gruppi fosfato, risultando in nucleotidi misti di tiofosfato di o trifosfati. La fosforilazione è possibile, ma la presenza di alfa tiofosfato rende le reazioni termodinamicamente sfavorevoli.

Conclusione

È evidente la rilevanza dello studio della farmacocinetica di dati e farmaci simili a quelli descritti, così come la creazione di modelli su diverse specie animali per una completa comprensione dei processi che avvengono nell'organismo dopo l'assunzione dei farmaci. In Russia sono in corso anche studi su tali farmaci.

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Una direzione promettente è lo sviluppo delle tecnologie genetiche.

1. Sono in grado di ottimizzare significativamente la farmacoterapia tradizionale (farmacogenomica).

2. Speciali speranze sono riposte nello sviluppo dell'ingegneria genetica di farmaci per la protezione da malattie infettive e agenti patogeni.

Un altro settore sono i preparati biotecnologici. Al via la competizione tra droghe sintetiche tradizionali e biofarmaci. Il nuovo termine “biofarmacia” sta diventando familiare.

Nel 2006 il volume del mercato farmaceutico mondiale era di circa 640 miliardi di dollari, mentre già il 10% rappresentava prodotti biotech. I leader nel campo della biofarmacia sono gli USA e la Germania.

Lo sviluppo dei moderni biofarmaci è stato preceduto dallo sviluppo di altri metodi biotecnologici, in particolare la fermentazione di batteri e funghi, che hanno consentito lo sviluppo della produzione industriale di farmaci a piccolo peso molecolare, come antibiotici, inibitori della HMG-CoA reduttasi (idrossi- metilglutaril-coenzima A-reduttasi) e immunosoppressori. I medicinali biotecnologici sono medicinali destinati alla profilassi, al trattamento o alla diagnostica in vivo, che sviluppano un'attività biologica anziché farmacologica. Hanno una serie di differenze significative rispetto ai farmaci chimico-sintetici. Il principio attivo dei preparati biotecnologici è di origine biologica ed è derivato da cellule viventi ed ha una struttura molecolare complessa ed eterogenea. Cellule di origine animale o microrganismi (ad es. batteri E. coli, lievito, ecc.) fungono da substrato iniziale, vengono utilizzate le loro strutture cellulari e subcellulari.

La differenza essenziale tra i farmaci biotecnologici è che utilizzano la capacità naturale di metabolizzare.

Per ottenerli, il DNA genomico del prodotto originale viene isolato e modificato in modo tale da acquisire una nuova capacità di biosintesi, non specifica per questa specie, che viene utilizzata nei farmaci. Prima di tutto, qui va citata la creazione di organismi geneticamente modificati per la produzione di proteine ​​terapeutiche ricombinanti. Attualmente sono già in uso 115 farmaci basati su 84 proteine ​​terapeutiche. Nel 2006 c'erano 418 biofarmaci in fase di sviluppo negli Stati Uniti e 320 in Europa, alcuni dei quali sono già in fase di sperimentazione clinica e saranno presto disponibili per i medici ei loro pazienti. Secondo previsioni ottimistiche, nel 2015 metà dei farmaci innovativi mondiali sarà a base di proteine ​​o oligonucleotidi. Dovremmo inoltre aspettarci l'ingresso nel mercato farmaceutico di una nuova categoria di farmaci - biosimilari - analoghi di originali farmaci biotecnologici con una molecola attiva simile ma non identica. Nell'UE quest'anno sono stati registrati i primi due biosimilari (ormone della crescita - somatotropina). Circa 12 biosimilari (eritropoietina, ecc.) sono registrati presso l'Agenzia europea per i medicinali. Si prevede che l'introduzione dei biosimilari nella pratica medica ridurrà drasticamente i costi sanitari per i medicinali biotecnologici e li renderà accessibili alla popolazione generale. Nelle mani dei medici ci saranno farmaci ancora più efficaci per combattere malattie gravi, molte delle quali prima erano considerate incurabili.

nucleotidi- Esteri fosforici di nucleosidi, nucleosidi fosfati. I nucleotidi liberi, in particolare ATP, cAMP, ADP, svolgono un ruolo importante nei processi energetici e informativi intracellulari e sono anche costituenti degli acidi nucleici e di molti coenzimi.

Si chiamano composti costituiti da due molecole nucleotidiche dinucleotidi, su tre trinucleotidi, da un piccolo numero - oligonucleotidi, e tra molti polinucleotidi, o acidi nucleici.

morfolino(Inglese) Morfolino) sono oligonucleotidi sintetici utilizzati in biologia molecolare per alterare l'espressione genica. I morfolinos oligomerici antisenso vengono utilizzati per impedire ad altre molecole di accedere a specifiche sequenze di acidi nucleici. Gli oligonucleotidi di morfolina bloccano piccole regioni a filamento singolo (circa 25 nucleotidi) sulla superficie delle molecole di RNA.

Oligonucleotidi antisenso sono lunghe sequenze di nucleotidi del DNA nei cromosomi. Se un gene deve essere espresso, viene avviato il processo di trascrizione di questo gene, a seguito del quale viene sintetizzato l'mRNA.

L'effetto terapeutico degli oligonucleotidi sintetici antisenso dipende dalla specificità della loro ibridazione con il sito accessibile del bersaglio dell'RNA m, dalla resistenza all'azione delle nucleasi cellulari e dalla presenza di un sistema di rilascio nella cellula.

Ad oggi, l'arresto mirato più efficace dell'attività di alcune regioni del genoma è effettuato dagli oligonucleotidi antisenso (AON). La strategia per l'utilizzo di AON si basa sull'interazione Watson-Crick delle molecole di DNA con l'mRNA bersaglio. La formazione di un eteroduplex DNA-mRNA porta all'inattivazione dell'M-RNA e alla successiva cessazione della sintesi proteica.

In altre parole, il meccanismo antisenso si riferisce al legame dell'oligonucleotide al sito complementare dell'RNA bersaglio e alla soppressione della funzione intracellulare di questo RNA.

Tuttavia, questo modello teorico semplice e attraente si è rivelato in realtà molto più complicato. Sono noti tre tipi di molecole antisenso: oligonucleotidi sintetici relativamente corti; RNA antisenso, espresso nella cellula dopo trasfezione con un gene del ribozima antisenso, avente attività catalitica.

La creazione di farmaci a base di oligonucleotidi antisenso è una delle più recenti direzioni nello sviluppo di farmaci. Questa tecnologia offre al ricercatore l'opportunità di influenzare direttamente quasi tutti i processi nella cellula con la massima specificità. Se una determinata proteina promuove la crescita di una cellula cancerosa, utilizzando l'oligonucleotide antisenso appropriato, si può garantire che questa proteina non verrà mai più sintetizzata nella cellula. Gli oligonucleotidi antisenso sono così specifici che è praticamente impossibile che qualsiasi altra proteina nella cellula venga influenzata. Questa specificità ridurrà gli effetti collaterali spesso osservati con i tradizionali trattamenti contro il cancro.

Il meccanismo di inattivazione non è ancora del tutto chiaro. Ma forse questo è dovuto al fatto che l'RNA a doppio filamento non è caratteristico delle cellule normali. Poiché il segnale per la sintesi di ciascuna proteina è un singolo mRNA, tale segnale per una particolare proteina può essere disattivato o "eliminato" utilizzando una tale sequenza complementare.

Fig.4 Il meccanismo di funzionamento dell'oligonucleotide antisenso

Un importante problema del trattamento con farmaci a base di oligonucleotidi antisenso è la distruzione di tali farmaci da parte di enzimi cellulari - nucleasi. Gli oligodeossinucleotidi sono degradati dalle nucleasi, quindi è molto importante proteggerli dall'azione di questi ultimi in modo che non perdano la loro capacità di ibridarsi con il bersaglio. Per fare ciò, viene eseguita la separazione elettroforetica delle proteine ​​cellulari, in cui viene inclusa un'etichetta radioattiva durante la traduzione e viene utilizzata la radioautografia per determinare quale degli oligonucleotidi "antisenso" riduce la sintesi di una particolare proteina. Non ci sono criteri generali per selezionare i migliori siti bersaglio in diverse trascrizioni di RNA. Possono essere efficaci oligonucleotidi complementari all'mRNA 5'- o 3'-konp, ai confini dell'esone e dell'introne e persino alle regioni a doppio filamento. Gli oligodeossinucleotidi sono degradati dalle nucleasi intracellulari, pertanto è importante proteggerli dall'azione di queste ultime in modo che non perdano la capacità di ibridarsi con il bersaglio. Per questo, le basi pirimidiniche e il desossiribosio possono essere modificati in un certo modo.

Pertanto, negli oligonucleotidi "antisenso" attualmente più utilizzati, l'atomo di ossigeno libero del legame fosfodiestere viene sostituito da un gruppo solfo, determinando la formazione di un legame tiofosfato. Gli oligonucleotidi così modificati si dissolvono in acqua, portano una carica negativa e non vengono scissi dalle endonucleasi. Dopo l'ibridazione con il sito bersaglio, formano duplex RNA-DNA che attivano la ribonucleasi (RNasi) H, un enzima endogeno che scinde l'mRNA nella molecola ibrida. Sono stati effettuati i primi studi clinici su tali oligonucleotidi, farmaci di prima generazione. Gli obiettivi sono l'RNA del citomegalovirus, il virus dell'immunodeficienza umana, nonché l'mRNA dei geni responsabili dello sviluppo del cancro, delle malattie intestinali e di altre malattie.

Oligonucleotidi sintetizzati "antisenso" con legami fosforamidite e poliammidico (peptide). Tali molecole sono molto resistenti all'azione delle nucleasi. I gruppi chimici attaccati all'atomo di carbonio 2' del residuo di zucchero e all'atomo C-5 delle pirimidine proteggono anche gli oligonucleotidi antisenso e facilitano il loro legame al sito bersaglio. ). Tutti i vantaggi di queste e altre modifiche sono ora oggetto di uno studio approfondito.