Генетические последствия инактивации хромосомы. Неслучайная инактивация х-хромосомы Неслучайная инактивация х хромосомы при онкологической патологии

мосомы. В 1949 г. Барр и Бертрам (Barr, Bertram, 1949) обнаружили в ядрах нейронов кошки интенсивно окрашенные тельца, расположенные вблизи ядерной оболочки. Позже эти тельца, названные тельцами Барра , были обнаружены у самок многих млекопитающих, в том числе и у человека: было показано, что они представляют собой неактивную Х-хромосому (рис. 11.2). Это означает, что, хотя в клетках самок содержатся две Х-хромосомы. а в клетках самцов - только одна, у самок транскрипционно активна может быть лишь одна Х-хромосома. Этот феномен называют компенсацией дозы гена . В одной из наиболее ранних работ по инактивации Х-хромосомы изучали закономерности окраски мышей (Магу Lyon, 1961). Если пигментация волосяного покрова определяется аутосомным геном, то окраска мыши будет либо такой, как у одного из родителей, либо промежуточной. В любом случае мышь будет одноцветной. Однако если самка мыши гетерозиготна по Х-сцепленному гену окраски, то результат будет совершенно иной: она будет пятнистой (рис. 11.3). Для объяснения этого феномена исследовательница предложила следующую гипотезу: 1) В ходе раннего развития самок млекопитающих обе Х-хромосомы активны. 2) Впоследствии

112 _______________ ГЛАВА 11______________________________________________________________________________

одна из Х-хромосом в каждой клетке выключается.

Эта инактивация происходит случайным образом. В одних клетках инактивируется отцовская Х-хромосома, тогда как в других – материнская.

3) Этот процесс является необратимым. Коль скоро Х-хромосома инактивировалась, она будет неактивной у всех потомков этой клетки. (Участки пигментации у этих мышей достаточно большие.) Таким образом, все ткани у самок млекопитающих являются мозаиками из клеток двух типов.

Некоторые из наиболее убедительных данных в пользу этой модели были получены в биохимических экспериментах с клонами клеток человека. Существует наследственная болезнь человека, называемая синдромом Леша–Найхана; эта болезнь характеризуется отсутствием фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), синтез которого контролируется Х-хромосомой. Синдром Леша–Найхана передается с Х-хромосомой. Это означает, что мужчины, несущие соответствующую мутацию в своей единственной Х-хромосоме, заболевают и умирают от этой болезни. У женщин присутствие мутантного гена ГФРТ может маскироваться другой Х-хромосомой, которая несет аллель дикого типа. Женщина, у которой имеются сыновья, страдающие этой болезнью, является переносчиком, поскольку у нее имеется мутантный ген ГФРТ на одной Х-хромосоме и ген ГФРТ дикого типа на другой Х-хромосоме. Если представленная выше гипотеза правильна, то у такой женщины клетка должна синтезировать либо активный, либо неактивный фермент ГФРТ в зависимости от того, какая Х-хромосома функционирует. Для проверки этого положения индивидуальные клетки кожи, взятые от женщины, гетерозиготной по гену ГФРТ, помещали в культуральную жидкость (Barbara Migeon, 1971). Каждая из этих клеток делилась, образуя клон. При окрашивании этих клонов на присутствие ГФРТ дикого типа было выявлено, что примерно половина клонов содержала этот фрагмент, а половина - нет (рис. 11.4).

Еще один ген Х-хромосомы кодирует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФДГ). У этого фермента имеются обычно два электрофоретических варианта: Г6ФДГ-А и Г6ФДГ-В. Для мужчин характерен вариант А либо В, тогда как женщины в отношении фенотипа по этому ферменту могут быть А, В или AB. В клетках кожи гетерозиготных женщин обнаруживаются оба варианта Г6ФДГ (рис. 11.5). Однако изолированные клоны, полученные после клонирования индивидуальных клеток кожи от этих гетерозигот, экспрессируют только один из двух возможных вариантов. Ни один из клонов не экспрессировал оба варианта (Davidson et al., 1963).

Гипотеза об инактивации Х-хромосомы прекрасно объясняет дифференциальную инактивацию генов на уровне транскрипции. О ее важности дополнительно свидетельствовали некоторые интересные исключения из общих правил. Во-первых, гипотеза оказалась справедливой в отношении сома-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ __________________________________ 113

Рис. 11.4. Устойчивая инактивация Х-хромосомы. Приблизительно 30 клеток от женщины, гетерозиготной по гену, обусловливающему недостаточность фермента ГФРТ, помещали в чашку Петри для культивирования. Клетки визуализировали с помощью радиоавтографии после инкубации в среде, содержащей радиоактивный гипоксантин. Клетки, содержащие ГФРТ, включают радиоактивные соединения в свою РНК и засвечивают фотографическую эмульсию, нанесенную поверх них. Клоны клеток без ГΦΡТ выглядят более светлыми, так как их клетки не могут включать радиоактивные соединения (Из Migeon, 1971; фотография с любезного разрешения В. Migeon)	Рис. 11.5. Две популяции клеток у женщин. Электрофорез препаратов, полученных из клеток кожи женщин, гетерозиготных по гену Г6ФДГ, показывает, что синтез происходит на обеих хромосомах, но на разных хромосомах в различных клетках. В культивированных гетерозиготных клетках кожи (дорожка 3) содержатся ферменты обоих типов. Однако в каждом клоне индивидуальных клеток кожи (дорожки 4–10) наблюдается только одна форма фермента.
	Рис. 11.6. В ооцитах млекопитающих обе Х-хромосомы активны. Электрофорез клеток из яичников (дорожки 1 и 2) и легкого (дорожка 3) 14-недельного плода человека, гетерозиготного по Г6ФДГ. Клетки легкого экспрессируют А(АА)- и В(ВВ)-формы фермента, тогда как клетки яичника содержат также гетеродимер (AB). Выраженные А- и B-зоны в случае яичников отражают тот факт, что клетки собственно яичников экспрессируют только А- и B-формы фермента, а гетеродимер экспрессируется только в ооцитах. (Фотография с любезного разрешения В. Migeon.)

тических клеток. В женских половых клетках неактивная Х-хромосома реактивируется незадолго до вхождения клеток в мейоз (Кratzer, Chapman, 1981; Gartler et al., 1980). Таким образом, в зрелых ооцитах обе Х-хромосомы оказываются активными. Это показано на рис. 11.6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа является димерным ферментом, поэтому каждая соматическая клетка содержит ферменты, построенные из двух А-субъединиц или из двух В-субъединиц. У гетерозиготной самки в одних клетках будет содержаться фермент, состоящий из двух А-субъединиц. тогда как в других - состоящий из двух В-субъединиц (в зависимости от того, какая Х-хромосома активна в конкретной клетке). Однако если в одной и той же клетке активны обе Х-хромосомы, то следует ожидать появления молекул этого фермента, состоящих из одной А-субьединицы и одной В-субъединицы. Именно это наблюдается в ооцитах (Gartler et al., 1973; Migeon, Jalalian, 1977). В них обнаруживается АВ-гетеродимер, что свидетельствует о транскрипционной активности в одной и той же клетке обеих Х-хромосом.

Вторая группа исключений касается случайного характера инактивации Х-хромосом. Правило случайности справедливо, однако иногда наблюдается предпочтительная инактивация отцовской Х-хромосомы. В тканях трофобласта самки мыши (у человека наблюдается иная ситуация) экспрессия материнской Х-хромосомы доминирует в такой степени, что отцовская Х-хромосома практически не экспрессируется. У сумчатых отцовская Х-хромосома также предпочтительно инактивируется во всех тканях зародыша (Sharman, 1971; Cooper et al., 1971). Мы пока не знаем, почему так происходит, но выяснение этого вопроса может оказаться ключе-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

114 _______________ ГЛАВА 11 _____________________________________________________________________

Инактивация X-хромосомы, ИXХ (англ. XIC, X-chromosome inactivation) — процесс дозовой компенсации генов у млекопитающих, который приводит к транскрипционной активности только одной половой X-хромосомы у самок и самцов. Инактивация происходит по правилу (n-1), где n — количество X-хромосом в ядре. X-хромосома — одна из двух половых хромосом у млекопитающих. У большинства млекопитающих самцы имеют половую Y-хромосому и одну X-хромосому, тогда как у самок — две X-хромосомы.

Классическое определение инактивации X-хромосомы — процесс, в котором одна из двух половых хромосом у самок млекопитающих становится неактивной.

Однако при определенных патологиях и анеуплоидии количество X-хромосом может быть другой: так при синдроме Клайнфельтера возможные варианты существ мужского пола XXY, XXXY, XXXXY; при синдроме Шерешевского-Тернера самки есть моносомиком по X-хромосоме — X0, также существуют самки-трисомик по X — XXX. Инактивация X-хромосомы происходит таким образом, что активной остается только одна X-хромосома, а все остальные превращаются в тельца Бара. (Например, в нормальной самки XX активной будет одна X-хромосома, вторая инактивируется, у самца с синдромом Клайнфельтера XXXY будет активной одна X-хромосома, две — нет).

История открытия

Открытию инактивации X-хромосомы Мэри Лайон в 1961 году предшествовала серия открытий в цитогенетике.

Работы Теодора Бовери (англ. Theodor Heinrich Boveri) 1888 привели сильные доводы в поддержку гипотезы, что именно хромосомы являются носителями генетической информации в клетке. Уже 1905 Натти Стивенс (англ. Nettie Maria Stevens) предложила теорию, половые хромосомы отличаются у разных полов. Эдмунд Уилсон (англ. Edmund Beecher Wilson) сделал аналогичное открытие независимо 1905 года. 1949 году работы Мюррея Барра (англ. Murray Llewellyn Barr) доказали, что пол дифференцированных соматических клеток модельных объектов может быть определено путем подсчета структур в ядре, которым дали название тельца Барра.

1959 Сусуму Оно (англ. Susumu Ohno) установил, что тельца Барра — то есть X-хромосома. 1959 В. Вельшонс (англ. WJ Welshons) и лианы Расселл (англ. Liane B. Russell) доказали, что мыши-моносомиком по X-хромосоме, X0, — фенотипически нормальные, способные к размножению самки, навело на мысль, что только одной X-хромосомы достаточно для нормального развития.

Мере Лайон (англ. Mary F. Lyon) 1961 изучала окраски меха мышей, что является признаком, сцепленной с полом, и кодируется в X-хромосоме. Она установила, что самцы XY всегда окрашены монотонно, тогда как самки XX могут быть фенотипическими мозаиками — иметь разноокрашенных мех, а самцы XXY также могут иметь различную окраску меха. Таким образом Мэри Лайон установила, что неактивная X-хромосома (у тельцах Барра), может быть как родительской, так и материнского происхождения.

По случаю 50 лет открытия инактивации X-хромосомы в июле 2011 года была проведена конференция Европейской Организации Молекулярной Биологии.

Механизм инактивации

У большинства млекопитающих, самки имеют две Х-хромосомы, в то время как самцы имеют одну Х-хромосому и одну Y-хромосому. Y-хромосома определяет пол в раннем эмбриональном периоде путем экспрессии транскрипционного фактора, кодируется SRY геном, который включает каскад реакций, приводящих к фенотипу самца. При отсутствии SRY развивается фенотип самки. У самцов (XY) и самок (XX) возникает неравновесие в дозе генов, особенно учитывая, что Y-хромосома намного меньше Х-хромосому, и кодирует лишь небольшое количество генов. Инактивация X-хромосомы балансирует такую ​​неравновесие.

Одна из Х-хромосом в клетках самок выключается эпигенетически, то есть последовательность нуклеотидов в ДНК не меняется. Вместо этого образуется плотный гетерохроматин — физико-химическое состояние всей хромосомы или ее части, в котором затруднена взаимодействие факторов транскрипции с ДНК — и процесс считывания РНК с этой хромосомы не происходит. Образование гетерохроматина происходит с помощью метилирования ДНК и модификации гистонов белков, а при инактивации Х-хромосомы важную роль играют длинные некодирующие РНК.

Процесс инактивации X-хромосомы состоит из нескольких этапов:

• подсчет X-хромосом;
• выбор хромосомы для инактивации;
• начало инактивации;
• поддержания X-хромосомы в неактивном состоянии.

В дальнейшем неактивная X-хромосома остается стабильно заглушенной. В этом важную роль играет метилирования ДНК — эпигенетический процесс, заключающийся в добавлении метильной группы к нуклеотида цитозина. Такая биохимическая изменение может поддерживаться долгое время и влиять на активность генов.

Компоненты гетерохроматина неактивной X-хромосомы отличаются от гетерохроматина в других хромосомах. На неактивной X-хромосоме найден вариант гистонов белка macroH2A, и белок Trithorax. Также установлено, что, в отличие от других хромосом, белковые компоненты неактивной X-хромосомы распределены равномерно по всей ее длине.

Изучение инактивации X-хромосомы пролило свет на несколько молекулярно-биологических процессов: роль длинных некодирующих РНК, геномный импринтинг и соматическое спаривания хромосом у млекопитающих.

Методика RAP-MS (англ. RNA antisense purification followed by quantitative mass spectrometry) позволяет изучать in vivo взаимодействие белков и длинных некодирующих РНК. С помощью RAP-MS в 2015 году установили, что для размещения днРНК Xist на хромосоме, необходимо действие белка SAFA (англ. Scaffold attachment factor A). Кроме этого, исключение (нокдаун) генов, кодирующих белки, SHARP (англ. SMRT and HDAC1-associated repressor protein) и LBR (англ. Lamin-B receptor) приводило к остановке инактивации X-хромосомы в опытах над эмбриональными стволовыми клетками мышей.

При размещении Xist на X-хромосоме с этой хромосомой уже не соединяется РНК-полимераза II — полимераза, которая транскрибирует большинство мРНК. Исключение гена, кодирующего SAFA приводило к хаотическому размещения Xist, тогда как исключение гена, кодирующего белок SHARP приводило к возвращению РНК-полимеразы II. Также белок SHARP взаимодействует с белками-ремодуляторамы структуры хроматина, такими как гистондеацетилазы. Причем, исключение гистондеацетилазы 3 (HDAC3), а не других видов гистондеацетилаз, приводило к нарушению механизма инактивации X-хромосомы.

Важным элементом инактивации является действие репрессивного комплекса Polycomb, PRC2 (англ. Polycomb repressive complex 2), однако действие комплекса PRC2 не важна при инициации процесса инактивации, скорее в поддержании хромосомы в инактивированном состоянии — триметилюванни 27 лизина H3 гистона (H3K27me3 см табличку "Сравнение еу- и гетерохроматина ")

ЦИX — центр инактивации X-хромосомы

Исследования на мышиных моделях установили, что для инактивации X-хромосомы нужна особая участок — центр инактивации X-хромосомы, ЦИX (англ. XIC, X inactivation centre). Центр инактивации X-хромосомы состоит примерно из миллиона пар оснований, имеет несколько элементов, участвующих в инактивации X-хромосомы, и содержит по крайней мере четыре гена. Для начала инактивации нужно два таких центра, по одному на каждой хромосоме, и необходимо, чтобы между ними была связь. Взаимодействие между двумя гомологичными X-хромосомами происходит в центре инактивации. Но остается открытым вопрос, что именно является причиной, а что следствием: или сближение хромосом приводит к началу инактивации, или наоборот.

Xist

В пределах участка центра инактивации X-хромосомы закодировано ген Xist (англ. X-inactive specific transcript), который транскриптуеться в длинную некодирующих РНК Xist. Xist покрывает ту X-хромосому, что будет неактивной (сначала в зоне ЦИX, а затем — по всей длине хромосомы). В процессе эмбрионального развития Xist экспрессируется с обеих хромосом, но потом в одной X-хромосоме экспрессия Xist прекращается (и именно эта хромосома останется активной). Подавление экспрессии Xist совпадает по времени с началом инактивации X-хромосомы.

При гетерозиготной мутации Xist, то есть такой, когда нормальный Xist есть только на одной из двух гомологичных хромосом, и X-хромосома, в которой есть мутантный Xist, а не инактивируется.

Tsix

С локуса центра инактивации X-хромосомы считывается антизмистовний транскрипт с комплементарной цепи ДНК того же гена Xist. Такой нкРНК дали название Tsix (Xist написан задом-наперед), и установили, что Tsix — отрицательный регулятор Xist, и его экспрессия необходима для поддержки X-хромосомы в активном состоянии. Много трудов указывают на то, что именно соотношение Tsix / Xist важно для выбора, который аллель будет глушиться, и, соответственно, какую хромосому будет инактивированная. Есть данные, что именно Tsix приводит к ассоциации двух гомологичных X-хромосом, и экспрессия Tsix РНК является необходимым, но не достаточным условием для подсчета и выбора хромосомы для инактивации

Tsix стала первой известной антизмистовною РНК млекопитающих, встречается в природе и имеет четкую функцию in vivo.

Дополнительные регуляторы

В зоне центра инактивации X-хромосомы найдено большое количество участков, которые влияют на процесс ИXХ. Такие участки влияют на процесс инактивации X-хромосомы как в цис, так и в транс-положении, то есть как на одной и той же хромосоме, на которой они расположены (цис-регуляторный элемент), так и на другой (транс-регуляторный элемент). Многие некодирующих РНК влияют на активность Xist и Tsix (Jpx, Ftx и Tsx).

Xite

Xite (англ. X-inactivation intergenic transcription element) — еще один некодирующих транскрипт, который расположен перед Tsix и действует как усилитель экспрессии Tsix на будущий активной X-хромосоме.

LINE1

В геноме человека значительную часть всей последовательности ДНК составляют так называемые транспозонов, или мобильные элементы генома. Часть их является Ретротранспозон (у человека Ретротранспозон занимают до 42% генома) — мобильными элементами, которые копируют и вставляют себя в геном с помощью транскрипции с ДНК на РНК, а затем обратной транскрипции с РНК в ДНК. LINE1 (англ. Long Interspersed Nuclear Elements) — один из активных ретротранспозонов у человека. LINE1 встречается в X-хромосоме гораздо чаще, чем в других хромосомах. Есть работы, которые указывают на участие РНК LINE1 в инактивации X-хромосомы.

Серия активаций и инактиваций X-хромосом

На начальных стадиях развития разница, какого происхождения X-хромосома, родительского или материнского. С начала эмбриогенеза X-хромосома отцовского происхождения всегда неактивна. В этом процессе важную роль играет геномный импринтинг. Затем, в период формирования бластулы обе X-хромосомы активируются. В дальнейшем развитии в эмбриональных клетках инактивация X-хромосом происходит в произвольном порядке, независимо от происхождения X-хромосом. Но в позаембриональних тканях (включая трофобластом, что формирует большую часть плаценты) активной остается только X-хромосома от матери, а родительская X-хромосома инактивируется.

Далее в зародыше при формировании будущих половых клеток (гаметогенез) происходит следующий этап активаций X-хромосом перед мейотического деления. Каждая из X-хромосом получает постоянную импринтну метку, указывающую, которого она происхождения.

Гены, считываются с неактивной X-хромосомы

Некоторые гены, расположенные на неактивной X-хромосоме, избегают подавления и экспрессируются с обеих X-хромосом. В человеческой линии фибробластов 15% генов, расположенных на неактивной X-хромосоме, в той или иной степени экспрессируются. Уровень считывания этих генов сильно зависит от того, в какой части хромосомы они закодированы. Такие гены приводят к многообразию, которое зависит от пола и типа ткани.

Инактивация X-хромосомы у разных видов

Основные работы по изучению инактивации X-хромосомы было сделано на мышах. В последние годы поступает все больше данных, мышиная модель инактивации X-хромосомы отличается от других млекопитающих.

У кроликов и людей Xist -гомолог не подлежит импринтинга, Xist считывается с обеих хромосом. У кроликов это может включить процесс ИXХ на обоих X-хромосомах.

Более того, X-хромосомы у многих видов имеют достаточно специфический набор генов: такие гены имеют низкий уровень экспрессии в соматических тканях, но высокий уровень экспрессии — в тканях, участвующих в репродуктивных функциях организма (например, яичники).

XACT РНК у человека

2013 исследователи РНК человека обнаружили длинную некодирующих РНК XACT (англ. X-active coating transcript), что связывается с активной X-хромосомой. XACT экспрессируется с активной X-хромосомы, но при дифференциации глушится, и уже в дифференцированных клетках (таких, как фибробласты) XACT РНК нет. При отсутствии XIST -РНК, XACT экспрессируется с обеих X-хромосом у человека, но не в мыши.

Сумчатые

У сумчатых форуме Xist -РНК и неизвестно, как происходит процесс инактивации X-хромосомы. Но у одного из видов опоссумов, Monodelphis domestica, найдено длинную некодирующих РНК Rsx (англ. RNA-on-the-silent X), которая похожа по функциям с Xist и участвует в инактивации X-хромосомы.

Случайность выбора X-хромосомы

Ранее считалось, что выбор хромосомы для инактивации полностью случайный, и каждая из двух гомологичных X-хромосом будет инактивированная с вероятностью 50%. Но появились публикации, доказывающие, что в некоторых модельных организмах генетические факторы влияют на выбор. Так, у мышей существуют регуляторные элементы (англ. Xce, X-controlling element), которые имеют три аллельные формы, и одна из них, Xce c, чаще встречается в активной X-хромосоме, тогда как Xce a чаще встречается в неактивной.

Остается невыясненным, в произвольном порядке происходит инактивация X-хромосомы человека. Последние исследования указывают на то, что генетическое окружение может влиять на выбор X-хромосомы, которая будет инактивированная.

Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих

Основное генетическое различие между полами заключается в наличии разного числа Х-хромосом - одна Х-хромосома у самцов и две у самок. Для того, чтобы компенсировать лишнюю дозу гена, у самок происходит инактивация Х-хромосомы. В раннем эмбриогенезе в эпибласте полностью инактивируется одна из Х-хромосом. Она конденсируется, переходя в неактивное состояние, превращаясь в тельце Барра (рис.1). Процесс инактивации Х-хромосомы называется дозовой компенсацией.

рис.1 Клеточное ядро самки с тельцем Барра - конденсированная Х-хромосома на фоне деконденсированных хромосом в интерфазе

Имеется два вида инактивации - специфическая, когда инактивируется определенная Х-хромосома, например только отцовская Х-хромосома у сумчатых (кенгуру), и случайная, когда выбор того, какая Х-хромосома будет инактивирована случаен (плацентарные млекопитающие). Хотя во внезародышевых органах плацентарных также происходит специфическая инактивация.
Центром инактивации является участок Х-хромосомы, называемый Xic (рис.2, 3), имеющий длину по разным данным 35, 80 тпн, или даже больше, что зависит от рассматривания прилежащих последовательностей, участвующих в регуляции инактивации. Xic содержит, как минимум, Xist - ген, кодирующий нетранслируемую RNA, Tsix - антисмысловой локус, содержащий различно метилируемый минисателлитный маркер DXPas34. Так же, очевидно, в формировании Xic участвует последовательность на 3" конце Xist. Вероятно, что другие регулирующие последовательности лежат дальше 3" конца гена Xist. Один из таких регуляторов содержит Xce локус, открытый как модификатор выбора Х-хромосомной инактивации.

рис. 2 (A) На рисунке показаны основные элементы инактивирующего центра, гены Xist и антисмысловой ген Tsix, соседние гены Tsx, Brx и Cdx. Предполагаемые участки, ответственные за выбор (красн.), счет дозы хромосом (желт.), и Xce (син.). Предполагаемые участки 35 kb и 80 kb мышиного Xic. (B) Этапы инактивации Х-хромосомы.

рис.3 Транскрипционная карта Xic района у мыши и человека. Показано 11 генов мышиного Xic района: Xpct, Xist, Tsx, Tsix, Chic1, Cdx4, NapIl2, Cnbp2, Ftx, Jpx и Ppnx. Гены, кодирующие белки, показаны желтым. РНК четырех из 11 генов Xist, Tsix, Ftx и Jpx нетранслируются, показаны красным. Гены, обнаруженные у мышей и человека, консервативны, кроме Ppnx и Tsix. Tsx у человека стал псевдогеном. Человеческий Xic длиннее мышиного примерно в три раза. Не смотря на такую разницу в размерах, расположение и ориентация генов одинакова. Исключением является Xpct, который имеет одинаковое положение, но инвертированную ориентацию. Места диметилирования лизина 9 в гистоне H3 и гиперацетилирования H4 показаны синим и зеленым под транскрипционной картой. Отдельно показаны минимальный промотор гена Xist, занимающий позицию -81- +1, и регуляторный элемент - сайленсер.

Инактивация разделяется на стадии: определение дозы, выбор, инициация, устанавливание и поддержание. Эти процессы являются генетически различными и все они, кроме поддержания, контролируются Xic.
Во время счета дозы клетка определяет число Х-хромосом относительно числа аутосом. Помимо локусов на аутосомах в этом этапе принимает участие участок за 3" конце Xist.
Во время выбора происходит определение того, какая из двух Х хромосом будет инактивирована. В этом процессе принимает участие последовательности в пределах Xist, Tsix и Xce.

Выбор того, какая Х-хромосома инактивируется, случаен, но это может регулироваться аллелями Xce (X-linced X controlling element). В различных мышиных линиях было обнаружено три таких аллеля - слабый Xcea, промежуточный Xceb и сильный Xcec. В гетерозиготах наиболее часто инактивируются те, которые несут более слабый аллель. Например, степень инактивации у гетерозигот Xcea/Xcec приблизительно 25:75. У гомозигот выбор происходит случайно. Xce локус расположен вблизи Xic. Предполагается, что Xce связывают транс-факторы, регулирующие работу генов в Xic, предопределяя выбор между Х-хромосомами. Инактивацию Х-хромосом можно увидеть, используя мышей с мутацией по гену окраски шерсти (например brindled ) на одной Х-хромосоме и нормальный ген на другой. Клетки дикого типа дают черный цвет, а мутантные белый. (рис.4)

рис.4 Визуализация инактивации определенной Х хромосомы.

В недифференцированных клетках изначально гены Xist и Tsix экспрессируются одновременно на каждой Х-хромосоме. Но позже на одной из Х-хромосом репрессируется ген Tsix, что ведет к увеличению уровня экспрессии Xist. РНК Xist присоединяет различные белки, образуя комплексы, которые распределяются вдоль всей Х-хромосомы, запуская ее инактивацию. На другой хромосоме не происходит репрессии гена Tsix и его антисмысловая РНК связывает РНК Xist, блокируя ее накопление (рис.5). Такая хромосома останется в активном состоянии. РНК гена Xist не способна переходить с одной Х-хромосомы на другую.

Рис.5 Модель работы Tsix. (A) Во время транскрипции Tsix блокируется транскрипция Xist. (B) Транскрипция Xist подавлятеся антисмысловой ориентацией RNA-полимеразы и всего транскрипционного комплекса. (С) Сайты, к которыми присоединяются РНК Xist-связывающие белки, могут блокироваться слиянием смысловой и антисмысловой РНК. (D) Появление нестабильного комплекса слившихся смысловой и антисмысловой РНК.

На более поздних этапах происходит замена H2A гистона его аналогом macro H2A (см. обзор Гистоны) и метилирование H3K27, участие различных транс-факторов, CpG метилирование ДНК в промоторах. В конечном итоге происходит установление гетерохроматина по общей концепции (см. обзор Гетерохроматин). Поддержание инактивации.
Инициация инактивации контролируется эксперссией Xist и, однажды установившись, инактивированное состояние больше не зависит от Xic и Xist. На гибридах человеческих и мышиных клеток показвно, что при делеции гена Xist человеческая Х-хромосома поддерживает инактивированное состояние, что указывает на независимое от Xist поддержание инактивации Х-хромосомы. Хотя присутствие Xist после установления инактивации стабилизирует ее.

Инактивация Х-хромосомы у Drosophila

Сокращения:
Xic - Х inactivation centre -Центр инактивации Х-хромосомы.
Xi -X inactive - инактивируемая Х хромосома.
Xa - X-active - активируемая Х хромосома.

Анеуплоидия по Х-хромосоме - одна из наиболее частых онтогенетических аномалий. Относительная устойчивость кариотипа человека к хромосомным аномалиям Х-хромосомы может объясняться инактивацией Х-хромосомы, процессом, эпигенетически подавляющим большинство генов в одной из двух Х-хромосом у женщин, не давая им производить какие-либо продукты. Здесь мы обсудим хромосомный и молекулярный механизмы инактивации Х-хромосомы.

Инактивация Х-хромосомы . Теория инактивации гласит, что в соматических клетках здоровых женщин (но не у мужчин) одна Х-хромосома инактивируется в начале эмбрионального развития, уравнивая таким образом экспрессию генов этой хромосомы у двух полов. В нормальных женских клетках выбор инактивируемой Х-хромосомы произволен, а затем поддерживается в каждом клоне клетки.

Таким образом, женщины мозаичны по экспрессии Х-сцепленных генов ; некоторые клетки экспрессируют аллели, унаследованные от отца, другие клетки - от матери. Этот образец экспрессии генов отличает большинство Х-сцепленных генов от импринтируемых генов (также экспрессирующих только один аллель, но определяемых родительским началом не случайно), а также от большинства аутосомных генов, экспрессирующих оба аллеля.

Хотя неактивная Х-хромосома сначала была обнаружена цитологически по присутствию гетерохроматиновой массы (названной тельцем Барра) в интерфазных клетках, существует много эпигенетических характеристик, различающих активные и неактивные Х-хромосомы. Проливая свет на механизмы Х-инактивации, эти особенности могут быть диагностически значимыми для установления неактивной Х-хромосомы в клиническом материале.

Хромосомные характеристики Х-инактивации :
- Инактивация большинства генов, расположенных на неактивной Х-хромосоме
- Произвольный выбор одной из двух Х-хромосом в женских клетках

Неактивная Х-хромосома:
а) гетерохроматиновая (тельце Барра)
б) поздно реплицируется в S фазе
в) экспрессирует XIST-PHK
г) связана с модификациями гистона macroH2A в хроматине

Область промотора многих генов в неактивной Х-хромосоме существенно модифицируется присоединением метильной группы к цитозину при действии фермента ДНК-метилтрансферазы. Как уже упоминалось в контексте геномного импринтинга в главе 5, такое метилирование ДНК связано с CpG динуклеотидами и приводит к неактивному состоянию хроматина. Дополнительные различия между активными и неактивными Х-хромосомами связаны с гистоновым кодом и оказались существенной частью механизма Х-инактивации.

У пациентов с дополнительными Х-хромосомами все Х-хромосомы , кроме одной, инактивируются. Таким образом, все диплоидные соматические клетки как у мужчин, так и у женщин, имеют единственную активную Х-хромосому, независимо от общего числа Х- или Y-хромосом.

Хотя инактивация Х-хромосомы , несомненно, является хромосомным феноменом, не все гены в Х-хромосоме подвергаются инактивации. Расширенный анализ экспрессии почти всех генов Х-хромосомы показал, что по крайней мере 15% генов избегают инактивации и экспрессируются как в активных, так и неактивных Х-хромосомах. Кроме того, еще для 10% генов показана переменная инактивация; т.е. они избегают инактивации у одних женщин, но инактивируются у других.

Примечательно, что эти гены не распределены произвольно по Х-хромосоме : большинство генов, избегающих инактивации, расположены на плече Хр (до 50%), по сравнению с Xq (несколько процентов). Данный факт имеет большое значение для генетического консультирования в случаях частичной хромосомной анеуплоидии X, так как дисбаланс генов на Хр может иметь большее клиническое значение, чем дисбаланс Xq.

Центр Х-инактивации и ген XIST

При исследованиях структурно аномальных инактивированных Х-хромосом был картирован центр Х-инактивации в проксимальном отделе Xq, в полосе Xql3. Центр Х-инактивации содержит необычный ген XIST (англ. Xinactivate specific transcripts; специфическая транскрипция инактивированной Х-хромосомы), оказавшийся ключевым управляющим локусом Х-инактивации. Ген XIST имеет новую характеристику: он экспрессируется только в аллеле на неактивной Х-хромосоме; он отключен на активной Х-хромосоме как в мужских, так и в женских клетках.

Хотя точный способ действия гена XIST неизвестен, Х-инактивация не может происходить в его отсутствие. Продукт XIST - некодирующая белок РНК, остающаяся в ядре в тесной ассоциации с неактивной Х-хромосомой и тельцем Барра.

Неслучайная инактивация Х-хромосомы

Х-инактивация в норме происходит в женских соматических клетках случайным образом и приводит к мозаицизму по двум популяциям клеток, экспрессирующих аллели одной или другой Х-хромосомы. Тем не менее существуют исключения из этого правила, когда в кариотипе имеются структурно аномальные Х-хромосомы. Например, почти у всех пациентов с несбалансированными структурными аномалиями Х-хромосомы (включая делеции, дупликации и изохромосомы) структурно аномальная хромосома всегда неактивна, что, вероятно, отражает вторичный отбор против генетически несбалансированных клеток, которые могли бы привести к значимым клиническим аномалиям.

Из-за преимущественной инактивации аномальной Х-хромосомы такие аномалии Х-хромосомы имеют меньшее влияние на фенотип, чем аналогичные аномалии аутосом, и, следовательно, более часто обнаруживаются.

Неслучайную инактивацию наблюдают также в большинстве случаев транслокаций X на аутосому. Если такая транслокация сбалансирована, избирательно инактивируется нормальная Х-хромосома, и две части транслоцированной хромосомы остаются активными, вероятно, снова отражая отбор против клеток с неактивированными аутосомными генами. В несбалансированном потомстве сбалансированного носителя, тем не менее, присутствует только продукт транслокации, несущий центр Х-инактивации, и такая хромосома неизменно инактивируется; нормальная Х-хромосома всегда активна.

Эти неслучайные образцы инактивации имеют общий эффект снижения, хотя и не всегда устранения, клинических последствий конкретного хромосомного дефекта. Поскольку образцы Х-инактивации хорошо согласуются с клиническим результатом, определение цитогенетическим или молекулярным анализом индивидуального образца Х-инактивации показано во всех случаях транслокации X и аутосом.

Одна закономерность, иногда наблюдающаяся у сбалансированных носителей транслокаций Х-хромосомы на аутосому, проявляется тем, что сам разрыв может вызывать мутации, нарушая ген в точке транслокации. Единственная нормальная копия конкретного гена инактивируется в большинстве или всех клетках из-за неслучайной инактивации нормальной Х-хромосомы, таким образом приводя к экспрессии у женщины сцепленного с полом признака, обычно наблюдающегося только у гемизиготных мужчин.

Выявлено несколько Х-сцепленных генов , когда типичный фенотип сцепленного с полом состояния обнаруживали у женщин с доказанной транслокацией Х-хромосомы на аутосому. Главный клинический вывод из этой информации - если женщина проявляет сцепленный с полом фенотип, обнаруживаемый обычно только у мужчин, показан хромосомный анализ с высоким разрешением. Обнаружение сбалансированной транслокации может объяснить фенотипическую экспрессию и выявить вероятную позицию гена на карте Х-хромосомы.

Barr и соавторы (1950), Klinger (1957) и др. предполагали, что половой хроматин образуется гетерохроматическими районами двух половых хромосом (XX). Доказательством этого они считали тот факт, что половой хроматин встречается в клетках самок млекопитающих, имеющих две Х-хромосомы, чего не наблюдается в клетках самцов, где присутствует только одна Х-хромосома. Незначительный процент клеток, содержащих половой хроматин, и его малая величина у самцов ставились в связь с тем, что из-за малых размеров Х-хромосомы в клетках мужских организмов не хватает материала для формирования телец Барра. Однако эта гипотеза в дальнейшем не подтвердилась. Против нее свидетельствовал, в частности, тот факт, что половой хроматин не обнаруживался в полиплоидных клетках самцов, где число Х-хромосом было достаточно для его формирования (Klinger, Schwarzacher, 1960)*.

Позднее было доказано, что половой хроматин образуется за счет одной Х-хромосомы. Ohno и соавторы (1959) исследовали цикл клеток крысы, установив, что только одна Х-хромосома клеток самки находится в гетеропикнотическом состоянии и в интерфазном ядре образует основную массу полового хроматина. То же самое было обнаружено и в клетках рака молочной железы мышей разных линий (Ohno, Hauschka, 1960) (рис. 2).

Рис. 2. Метафазные пластинки нормальной женской клетки до и после ауторадиографии. Стрелка указывает на поздноредуплицирующуюся Х-хромосому (по Kikuchi, Sandberg, 1965).

В дальнейшем Ohno и Makino (1961), используя радиоактивную метку (Н3-тимидин) и авторадиографию в культуре ткани костного мозга индивидов с различным числом Х-хромосом в соматических клетках, обнаружили, что только одна Х-хромосома редуплицируется одновременно с аутосомами, подвергаясь спирализации и инактивации, а вторая Х-хромосома отстает в своем цикле. Исследования Taylor (1960), Morishima и соавторов (1962), German (1964) и др. подтвердили существование поздно редуплицирующейся Х-хромосомы, находящейся в гетеропикнотическом состоянии, обычно располагающейся по периферии интерфазного ядра и цитологически обнаруживающейся в виде телец Барра.

Было установлено, что по количеству глыбок полового хроматина можно судить о числе Х-хромосом. Согласно правилу Stewart (1960), количество глыбок полового хроматина в каждом диплоидном наборе равно n-1 (n - число Х-хромосом). Так, например, в тетра-плоидных клетках и интерфазных ядрах содержатся два тельца полового хроматина. Женщины Х0-негативны по половому хроматину, а клетки женщин - XX и мужчин - XXY несут лишь по одному тельцу полового хроматина (А. А. Прокофьева-Бельговская, 1963; Barr, 1959).

Учение об инактивации одной из Х-хромосом в соматических клетках женского организма было сформулировано почти одновременно несколькими исследователями, работавшими независимо друг от друга. Например, Beutler и соавторы (1962) показали, что ферменты, контролируемые генами, локализованными в Х-хромосоме, обнаруживаются примерно в одинаковом количестве как у женщин, так и у мужчин, хотя, казалось бы, у женщин таких ферментов при наличии двух Х-хромосом должно быть в 2 раза больше. Отсюда следовало, что из двух Х-хромосом клеток женского организма функционирует только одна, а вторая - инактивирована и образует глыбку полового хроматина. Было также доказано, что у женщин-гетерозигот по дефициту энзима Г6ФД имеются две популяции эритроцитов: одна - с нормальным и вторая с мутантным геном (Beutler et al., 1962; Gartler et al„ 1962a, b).

Примерно в то же время были опубликованы еще две сходные гипотезы -«инактивированной Х-хромосомы» (Lyon, 1961, 1962) и «фиксированной дифференциации Х-хромосомы» (Grumbach et al., 1960, 1962). Однако Lyon первой более четко сформулировала основные закономерности поведения Х-хромосом в клетках млекопитающих.

Переход одной из Х-хромосом в гетеропикнотическое состояние означает ее инактивацию, преследующую цель «компенсации дозы»: в клетках женского и мужского организма остается по одной активно функционирующей Х-хромосоме. Считается, что Y-хромосома содержит в основном локусы, определяющие развитие организма в сторону мужского пола (Galton, 1966).

Основные положения гипотезы Lyon сводятся к тому, что у млекопитающих в клетках развивающегося эмбриона женского пола, находящегося на ранних стадиях формирования, происходит переход в гетеропикнотическое состояние (инактивация) одной из Х-хромосом. В одних клетках инактивации подвергается отцовская, в других - материнская (по происхождению) Х-хромосома.

A. A. Prokofjeva-Belgovskaya (1966), а также Grumbach и соавторы (1962) указывают, что у насекомых (дрозофила) в противоположность тому, что наблюдается у млекопитающих, инактивации подвергается только отцовская Х-хромосома, сохраняющая в клетках взрослых особей свое гетеропикнотическое состояние. Последнее характерно для хромосомы на всех стадиях сперматогенеза.

В каждой клетке эмбриона женского пола у млекопитающих выбор того, какая Х-хромосома будет инактивирована- отцовская или материнская,- происходит случайно **. Поэтому представляется справедливым замечание, которое сделал Griineberg (1967): так как предполагается, что инактивация происходит па ранних стадиях развития, когда клетки данной структуры весьма немногочисленны, то случайный подбор «образцов инактивации» может вести к неравномерному распределению клеток с нормальным и мутантным фенотипом (у взрослых особей); допустимо даже, что все клетки могут быть одного «сорта».

Таким образом, возникает мозаичность соматических клеток женского организма: в одних клетках половой хроматин образован гетеропикнотической Х-хромосомой отцовского, в других - материнского происхождения. При наличии гетерозиготности эта мозаичность может служить объектом генетического анализа.

Lyon приводит некоторые доказательства справедливости своей гипотезы. Например, мыши с генотипом Х0 имеют нормальный фенотип; это указывает на то, что одна Х-хромосома оказывается достаточной для нормального развития организма. Мыши, гетерозиготные по локусу, сцепленному с полом, имеют мозаичный фенотип; все сцепленные с полом мутанты по окраске шерсти отличаются этой особенностью. Такая же мозаичность развивается и в случае транслокации аутосомного сегмента на гетеропикнотическую Х-хромосому (см. главу VI).

В опытах на самках мышей, гетерозиготных по двум неаллельным генам, Lyon (1963) показала, что в том случае, когда гены-мутанты расположены на разных Х-хромосомах, одновременной фенотипической экспрессии обоих мутантов в одних и тех же участках тела (например, при изучении окраски шерсти) не наблюдалось. Эти опыты подтверждали справедливость учения о неактивной Х-хромосоме.

De Mars (1967) предполагает, что в Х-хромосоме имеются специальные гены, выделяющие вещества, индуцирующие спирализацию Х-хромосомы. Этот эффект De Mars считает элементарным процессом репрессии, охватывающим целиком всю гетеропикнотическую Х-хромосому и препятствующим ее репликации и считыванию генетической информации. При этом видимая в световом микроскопе конденсация хроматина является частым, но не обязательным условием репрессии неактивной Х-хромосомы.

В соответствии с гипотезой Лайон способность Х-хромосомы к переходу в гетеропикнотическое состояние наследуется в клеточных поколениях. Comings (1966) приводит литературные данные, подтверждающие это положение: клоны фибробластов, взятых у одной негритянки, гетерозиготной по электрофоретическим А- и В-вариантам сцепленного с Х-хромосомой энзима Г6ФД, синтезировали только А- или только В-линию, но не обе вместе. Comings, используя депрессоры Х-хромосомы (полиэтиленсульфонат и другие полианионы), на культуре фибробластов показал, что эти агенты не дают эффекта де-репрессии, из чего следовало, что инактивация обусловлена не спирализацией хромосомы, а ядерными протеинами.

Такой вывод покоится на том основании, что в опытах автора, несмотря на уменьшение в культуре числа фибробластов, имеющих половой хроматин, каждый клон гетерозиготных клеток обнаруживал присутствие только одного из вариантов энзима Г6ФД (А или В).

Гипотезу Лайон подвергает критическому анализу Griineberg (1966, 1967). Изучив эффект сцепленных с полом генов, он делает вывод, что гипотеза Лайон отвергается на многоклеточном и частично подтверждается на клеточном уровне. Выделив из известных 60 генов человека, сцепленных с полом, 26 генов с доказанной гетерозиготностью, он подразделил их на три группы. В первую группу (17 генов, например, дальтонизма) вошли гены, для которых известен лишь большой (многоклеточный) эффект; во вторую - 4 гена с гуморальной проявляемостью (гемофилия и др.); в третью - 5 генов, действие которых прослеживается на клеточном уровне (например, дефицит энзима Г6ФД и др.).

Мы не имеем возможности подробно остановиться на этой работе, однако отметим, что не всегда позиция автора представляется достаточно обоснованной. Отклонения фенотипа (на многоклеточном уровне) от того, который можно было бы предсказать на основании гипотезы Лайон, могут развиваться в силу многих, еще неясных причин. Lion (1961) отмечает, например, что наличие определенного числа нормальных клеток, присутствующих в мозаике с мутантными, может обеспечивать нормальный фенотип; в других случаях в аналогичной ситуации возможна неполная пенетрантность признака у гетерозигот. Такую трактовку можно признать вполне приемлемой. А. А. Нейфах (1965) указывает, что клетки различного генотипа могут обмениваться продуктами своей жизнедеятельности, при этом мутантные клетки приобретают нормальный фенотип. Эти, в частности, соображения необходимо учитывать при оценке эффекта генов на многоклеточном уровне.

Отклонения со стороны фенотипа, противоречащие на первый взгляд гипотезе Лайон, могут стоять в связи с существованием в неактивной Х-хромосоме активно функционирующих локусов (см. главу VI).

Учение о генетической инактивации Х-хромосомы подробно излагается в работах А. Ф. Захарова (1968), Lyon (1966), Ohno (1967) и др.

Кроме гипотезы Лайон, имеется, как уже отмечалось, еще одна, родственная ей гипотеза «фиксированной дифференциации Х-хромосомы», выдвинутая примерно в то же время Grumbach и соавторами (1960, 1962, 1963). Эти авторы защищают те же представления, что и Lyon. Они показали, что содержание энзима Г6ФД в эритроцитах мужчин и женщин лежит в пределах нормы. Это обстоятельство Grumbach и сотрудники рассматривают как веское доказательство учения о «единственной активной Х-хромосоме». Рассматривая инактивацию гетеропикнотических Х-хромосом как механизм «компенсации дозы», они отмечают, что экстрааутосомы в противоположность сверхчисленным половым хромосомам обычно служат причиной сильных фенотипических сдвигов, поскольку они остаются в активном состоянии.

Существенным моментом исследований на мышах, предпринятых Grumbach с соавторами, являются данные о том, что в соматических клетках женского организма гетерохроматинизации, т. е. инактивации, как правило, подвергается структурно измененная Х-хромосома (деления, транслокация аутосомных сегментов)***. Характерно, что в этих случаях величина телец Барра отражает характер структурного нарушения формирующей их Х-хромосомы (уменьшение в случае делеции, увеличение при транслокации)****. Эту закономерность подтвердили Klinger и соавторы (1965), а также Ockey и соавторы (1966).

Очевидная предпочтительная гетерохроматинизация измененной Х-хромосомы, по Grumbach и соавторам (1963), Gartler и Sparkes (1963), может объясняться селекцией клеток, происходящей после того, как во всех эмбриональных клетках произошла гетерохроматинизация одной из Х-хромосом (наугад: в одних клетках отцовской, в других - материнской). В случае транслокации аутосомного элемента на Х-хромосому инактивация последней влечет за собой, как показали некоторые авторы, инактивацию и прикрепившихся аутосомных локусов, В результате возникает несбалансированность генотипа и из-за понижения жизнеспособности клетки с измененной Х-хромосой постепенно элиминируются.

Однако при возникновении трисомии по транслоцированному аутосомному сегменту, наоборот, вполне жизнеспособными могут оказаться как клеточные варианты с инактивированной Х-хромосомой, несущей аутосомный элемент, так и клетки с нормальным набором XX.

Инактивация аберрантной Х-хромосомы, таким образом, может обеспечивать генетическую сбалансированность, при этом состояние анеуплоидности носит лишь кажущийся характер.

Представляет интерес и другое объяснение, которое предлагают Grumbach и соавторы для анализа факта предпочтительной инактивации структурно измененных Х-хромосом. Авторы говорят о так называемой селективной индукции, развивая «модель эписомального фактора».

Некоторый эписомальный фактор в период раннего эмбриогенеза инкорпорируется в Х-хромосому, в ее специальный рецептивный локус (в каждой клетке). Сразу после этого происходит выработка вещества, которое комбинируется с другим неинкорпорированным фактором клетки и инактивируется им. Поэтому другая Х-хромосо-ма теряет возможность перехода в изопикнотическое состояние. На базе этих представлений можно легко понять хорошо известный фактор, заключающийся в том, что в клетках, независимо от общего числа Х-хромосом, всегда присутствует только одна изопикнотическая хромосома, успевающая (в ранних эмбриональных клетках) первой захватить гипотетический эписомальный фактор.

Grumbach и соавторы допускают еще, что Х-хромосома, лишившаяся эписомального фактора, начинает продуцировать вещество, репрессирующее синтез молекул РНК на ДНК (типа актиномицина D) и способное как-то тормозить способность ДНК к репликации (что соответствует явлению запаздывания гетероциклической Х-хромосомы в митотическом цикле).

Роль эписомального фактора, таким образом, сводится к предупреждению образования вещества репрессора в Х-хромосоме, которая должна остаться в активном состоянии. Эта схема хорошо объясняет факт предпочтительной гетерохроматинизации Х-хромосомы, имеющей делецию (утрата рецептивного локуса, захватывающего эписомальный фактор), но не может удовлетворительно трактовать это явление, если имеется Х-хромосома с транслоцированным аутосомным участком. Evans и соавторы (1965) не подтвердили факта предпочтительной гетерохроматинизации структурно измененной Х-хромосомы (Х-аутосомная транслокация) в клетках у мышей.

* Villaescusa (1967) обнаружил, что 10-29% таких высокоплоидных клеток, как мегакариобласты и мегакариоциты костного мозга и селезенки самцов крыс, содержат тельца Барра.
** Ауторадиографический анализ кариологических данных, полученных на лейкоцитах мула, подтверждает это положение (Mukherjee, Sinha, 1964).
*** Grumbach и соавторы ссылаются на работу Ohno (1962), который не нашел такой предпочтительной гетерохроматинизации структурно измененной Х-хромосомы в клетках у мышей.
**** Taft и соавторы (1965) нашли, что при кариотипе XX площадь тельца полового хроматина ядер буккальных клеток составляет 0,70-0,84 µ 2 , при делении длинного плеча Х-хромосомы - 0,34 µ 2 , а при наличии изохромосомы-Х-0,89-0,97 µ 2 .