Методы введения чужеродной днк в клетки грибов. Новый метод доставки днк в эмбриональные стволовые клетки

Введение

1 Основные группы ферментов генетической инженерии

1.1 Рестриктазы

1.1.1 Механизм действия рестриктаз

1.1.2 Построение рестрикционных карт

1.3 Лигазы

2 Введение нового гена в клетку

2.1 Регуляция экспрессии гена у прокариот

2.2 Способы прямого введения гена в клетку

2.3 Введение генов в клетки млекопитающих

2.4 Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих

2.5 Генотерапия

2.6 Получение трансгенных животных

Заключение

Список литературы

Введение

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

Конструирование рекомбинантной ДНК;

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генетической инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

1 Основные группы ферментов генетической инженерии

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

Ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

Ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

Ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

1.1 Рестриктазы

Общепринято термины "рестриктаза", "эндонуклеаза рестрикции" и "сайт специфическая эндодезоксирибонуклеаза" считать синонимами.

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Наряду с рестрикционной активностью бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК; для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания.

Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3.

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве кофакторов.

В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.

Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой R1 из E. coli.

К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - Eco R I (из Escherichia coli) и Hind III. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4. Представленное изобретение может быть использовано для направленной доставки генетических конструкций в стволовые и злокачественные опухолевые клетки с целью коррекции генных дефектов и предотвращения заболеваний. Способ включает подготовку носителей генетических конструкций путем включения в состав молекул носителя, представляющего собой ДНК-связывающую последовательность из восьми остатков аминокислоты лизина - КККККККК, сигнальных последовательностей. Присоединение сигнальной последовательности к ДНК-связывающей последовательности осуществляют с помощью линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты. После чего осуществляют формирование комплексов ДНК/носитель. Затем проводят трансфекцию in vitro. Предложенное изобретение позволяет повысить эффективность доставки гена интереса в опухолевые и стволовые клетки. 2 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к генной медицине, генной терапии, биотехнологии и фармацевтике и может быть использовано для направленной доставки генетических конструкций в стволовые и злокачественные опухолевые клетки с целью коррекции генных дефектов и предотвращения заболеваний. Тканеспецифичность доставки генных конструкций обеспечивается благодаря использованию сигнальных последовательностей к рецептору CXCR4, который экспрессируется в клетках данного типа.

Генную терапию от подходов традиционной медицины отличает ее ориентированность на борьбу с причиной заболевания, а не с симптомами и последствиями. В настоящее время ведется разработка генотерапевтических подходов к лечению или профилактике широкого спектра заболеваний человека. Эти подходы могут быть применимы для терапии in vivo и ex vivo. Терапия in vivo основана на прямом введении генетических конструкций непосредственно в ткани организма. Доставка может осуществляться внутривенно с использованием аэрозольных распылителей или инъекций в определенные ткани. Генная терапия ех vivo основана на выделении специфического типа клеток из организма, введении в них "терапевтической" генной конструкции, отборе трансфецированных клеток и последующей реимплантацией пациенту.

В разрабатываемых в настоящее время подходах к доставке генетических конструкций выделяется три основных направления:

1) клонирование в составе вирусных векторов;

2) использование физических методов трансфекции;

3) использование комплексов плазмидных векторов экспрессии и молекул невирусных носителей.

Вирус-опосредованный перенос является высокоэффективным способом доставки ДНК в клетки-мишени, поскольку проникновение модифицированного вирусного вектора осуществляется аналогично процессу, происходящему в естественных условиях при переносе генома вируса в клетки хозяина. Наиболее изученными являются векторы, созданные на основе ретро-, адено-, аденоассоциированных вирусов. К достоинствам вирусов относится, прежде всего, сочетание в себе свойств вектора экспрессии и носителя, возможность специфичной доставки, способность трансфецировать делящиеся и неделящиеся клетки, возможность встраивания ДНК в хромосому для обеспечения долговременной экспрессии. Благодаря таким преимуществам данный подход до сих пор широко используется в исследованиях по доставки генов, хотя и имеет некоторые недостатки. Ретро- и аденоассоциированные вирусы имеют ограниченный размер клонированного фрагмента ДНК и риск инсерционного мутагенеза при встраивании вируса в геном хозяина. Серьезным недостатком аденовирусных векторов является ярко выраженный иммунный ответ при высоких дозах и повторных введениях аденовирусных конструкций (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. - 2000. - v.60. - P.249-271, патент РФ №2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, опубл. 2005.05.20).

Инъекции конструкций "голой" (naked) плазмидной ДНК были одним из первых подходов при разработке стратегий генотерапевтического лечения. Низкая эффективность трансфекции с использованием «голой» ДНК послужила толчком к разработке новых методов доставки генетических конструкций. Изучены различные физические способы доставки ДНК в клетки организма. Наиболее популярными среди них являются метод баллистической трансфекции и электропорация, которые широко применяются для трансфекции клеток кожи и мышц. Метод баллистической трансфекции основан на проникновении в клетку ДНК, осажденной на золотых или вольфрамовых микрочастицах. Трансфекция происходит под давлением потока сжатого газа или жидкости. Метод электропорации основан на локальном изменении электрического потенциала клеточной мембраны вследствие воздействия электрическим током. Электрические импульсы приводят к образованию пор в клеточной мембране, тем самым делая ее проницаемой для биомолекул. Для преодоления низкой эффективности трансфекции голой ДНК in vivo также используют метод гидродинамического шока - внутривенное или внутриартериальное введение плазмидного вектора в растворе большого объема. Основными недостатками существующих физических методов трансфекции являются невысокая эффективность и локальность эффекта доставки ДНК. Они позволяют плазмиде преодолеть клеточную мембрану и избежать включения в эндосомы, предотвращая таким образом энзиматическую деградацию, но, как правило, не обеспечивают длительной персистенции введенных генетических конструкций (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods // Gene Ther. - 2004. - v.11, №18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene therapy. - 2003. - v.10, №6. - P.453-458).

Невирусные носители являются альтернативой вирус-опосредованному переносу генетических конструкций в клетки млекопитающих. Невирусные носители легко синтезируются, легкость их модификации позволяет вносить изменения в структуру и состав молекул, тем самым совершенствуя средства доставки. При использовании невирусных носителей отсутствуют ограничения на размер доставляемого вектора экспрессии. Кроме того, они менее токсичны, в большинстве случаев не вызывают специфического иммунного ответа и более безопасны в применении in vivo no сравнению с вирусными векторами. Поэтому введение генетической конструкции, упакованной в невирусные носители, может осуществляться повторно. Исследование невирусных носителей развивается в направлении улучшения трансфецирующих свойств плазмидной ДНК путем образования комплексов ДНК с различными синтетическими соединениями (липидами, олиго- и полипептидами, полимерами и др.) (например, патент РФ №2336090, А61К 39/00, A61K 47/00, опубл. 2008.10.20). Совершенствование невирусных средств доставки во многом зависит от детального понимания барьеров на пути проникновения ДНК в клетки организма (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, №2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in gene therapy // Med Sci Monit. - 2005. - v.11, №4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gene delivery // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, №2. - P.203-217).

Считается, что невирусный носитель должен обладать следующими характеристиками:

1) быть нетоксичными, компактизовать и защищать плазмидную ДНК от ферментативной деградации, выводиться из организма после использования;

2) обеспечивать проникновение плазмиды в клетку путем специфического связывания с плазматической мембраной клетки:

3) обладать способностью к высвобождению ДНК из эндосомального компартмента;

обеспечивать диссоциацию ДНК из комплекса для последующего транспорта плазмиды в ядро.

Для целей генотерапии наиболее предпочтительным способом доставки генетических конструкций является их тканеспецифичный перенос в клетки и ткани организма.

Первым барьером на пути внутриклеточного проникновения комплексов является плазматическая мембрана. Большинство комплексов взаимодействуют с поверхностью клетки с помощью электростатических сил. Возможным механизмом связывания комплексов с клеткой является их взаимодействие с белками клеточной поверхности - гликозаминогликанами. Однако при данном механизме проникновения комплексов отсутствует тканеспецифичный перенос генных конструкций. В то же время проблема тканеспецифичной доставки генетических конструкций актуальна для генной терапии целого ряда заболеваний. Для специфического взаимодействия с клеточной поверхностью в состав комплексов включают лиганды к рецепторам на поверхности клеток. В настоящее время охарактеризован ряд пептидных лигандов интегринов. К ним относится, в частности, трипептидный фрагмент RGD (интегрины присутствуют на поверхности многих клеток), трансферрин (его рецептор обладает повышенной экспрессией в пролиферирующих клетках), асиалоорозомукоид (асиалогликопротеиновый рецептор имеет специфическую экспрессию в гепатоцитах печени).

Для специфической доставки генетического материала в нервные клетки Зенг с коллегами предложили использовать носитель, состоящий из сигнального участка к рецептору TrkA (80-108 аминокислоты из фактора роста нервов) и ДНК-связывающей последовательности из 10 остатков аминокислоты лизина. Данный носитель в присутствии эндосомолитического агента хлороквина, способствующего выходу комплексов из эндосомального компартмента клетки, был способен тканеспецифично доставлять маркерный ген только в клетки с экспрессией рецептора TrkA. Данный носитель можно применять для генотерапевтического лечения различных неврологических заболевания, таких как эпилепсия, болезни Паркинсона и Альцгеймера. Однако он не пригоден для доставки генетического материала в другие типы клеток (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S A synthetic peptide containing loop 4 of nerve growth factor for targeted gene delivery // J Gene Med 2004; 6: 1247-1256).

Стволовые клетки человека рассматриваются в качестве перспективных агентов для клеточной и генной терапии различных заболеваний человека. В то же время они относятся к одним из наиболее трудно трансфецируемых типов клеток. При генотерапевтическом лечении раковых заболеваний необходимо обеспечить доставку генов непосредственно в опухолевые клетки.

CXCR4 является рецептором фактора миграции стволовых клеток хемокина SDF-1α. CXCR4 экспрессируется в гематопоэтических клетках, эндотелии сосудов, мышечных сателлитных клетках. Отмечен высокий уровень экспрессии данного гена в более чем 20 видах раковых опухолей (рак груди, простаты и др.), а также в мигрирующих стволовых клетках. Рецептор CXCR4 также способен связываться с вирусным хемокином vMIP-II (вирус саркомы Капоши). Таким образом, включение в состав молекул носителя сигнальных последовательностей для связывания с рецептором CXCR4 является перспективным путем создания систем целевой доставки генов в опухолевые и стволовые клетки.

Для доставки генетического материала в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, Ле Бон с коллегами использовали синтетический лиганд к данному рецептору - AMD3100, который был соединен с полиэтиленимином или катионными липидами. Комплексы генетического материала с данными соединениями не приводили к достоверному повышению эффективности доставки маркерного гена в CXCR4+ клетки по сравнению с соединениями без сигналов. Носители, применяемые Ле Боном, не были эффективными, потому что специфическая доставка с их помощью возможна только при добавлении в среду трансфекции вещества, способствующего интернализации рецептора CXCR4 (форболовый эфир). (Le Bon В, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells. // Bioconjugate Chem 2004, 15: 413-423).

Таким образом, существует необходимость в создании носителя генетических конструкций, способного обеспечить специфическую доставку в CXCR4(+) клетки и не оказывать влияния на близлежащие ткани. Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

В основу изобретения положена задача разработки способа специфической доставки генетических конструкций в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, в котором за счет использования носителей генетических конструкций, содержащих в своем составе сигнальные последовательности к рецептору CXCR4, достигают повышения эффективности доставки гена "интереса". Важно отметить, что синтез заявляемых носителей может быть осуществлен с помощью любого из известных методов твердофазного пептидного синтеза.

Решение поставленной технической задачи обеспечивается тем, что в способе направленной доставки ДНК в опухолевые и стволовые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, включающем подготовку носителей генетических конструкций путем включения в состав молекул носителя, представляющего собой ДНК-связывающую последовательность из восьми остатков аминокислоты лизина - KKKKKKKK, сигнальных последовательностей, формирование комплексов ДНК/носитель, проведение трансфекции in vitro, сигнальную последовательность выбирают из группы: фрагмент с 1 по 8 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYR; фрагмент с 1 по 17 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, где 9 и 11 аминокислоты заменены на серин; или фрагмент с 1 по 10 аминокислоту N-терминальной последовательности вирусного хемокина vMIP-II - LGASWHRPDK; присоединение сигнальной последовательности к ДНК-связывающей последовательности осуществляют с помощью линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты.

При этом сигнальная последовательность может представлять собой фрагмент с 1 по 8 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α-KPVSLSYR.

Либо сигнальная последовательность может представлять собой фрагмент с 1 по 17 аминокислоту последовательности N-конца белка SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, где 9 и 11 аминокислоты заменены на серин.

В качестве сигнального участка также может быть использован фрагмент с 1 по 10 аминокислоту N-терминальной последовательности вирусного хемокина vMIP-II - LGASWHRPDK, синтезированный из D-аминокислот.

В качестве компонента, обеспечивающего выход из эндосом комплексов, состоящих из носителей и генетического материала, может быть использован глицерин или хлороквин.

В качестве генетического материала для носителей может быть использована плазмидная ДНК.

Указанный технический результат в предлагаемом изобретении достигается за счет использования в качестве носителя молекул олиголизина - КККККККК (К8), конъюгированных с сигнальными последовательностями к рецептору CXCR4 из белков SDF-1 или vMIP-II, а именно N-концевую последовательность хемокина SDF-1 (с 1 по 8 аа) либо N-концевую последовательность хемокина SDF-1 (с 1 по 17 аа, с заменой 9 и 11 аа на серин) или N-концевую последовательность вирусного хемокина vMIP-II (с 1 по 10 аа в D-конформации). Наличие олиголизина КККККККК в составе носителя позволяет конъюгатам образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами, в частности с плазмидной ДНК, за счет электростатического взаимодействия.

Указанный технический результат достигается тремя вариантами заявляемого носителя.

Указанный технический результат по первому варианту достигается тем, что в носителе short CDP на основе синтетических аналогов хемокина SDF-1, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-8 аа) последовательности N-конца белка SDF-1, имеющий структуру KPVSLSYR и обладающий активностью агонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру KKKKKKKK и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты (Ahx).

Указанный технический результат по второму варианту достигается тем, что в носителе (long CDP) на основе синтетических аналогов хемокина SDF-1, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-17 аа; аа9 и аа11 заменены на серин) последовательности N-конца белка SDF-1, имеющий структуру KPVSLSYRSPSRFFESH и обладающий активностью агонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру KKKKKKKK и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты.

Указанный технический результат по третьему варианту достигается тем, что в носителе (viral CDP) на основе синтетических аналогов белка вируса саркомы Капоши vMIP-II, включающем катионную составляющую, представляющую собой олиголизин К8, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с рецептором CXCR4, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют фрагмент (1-10 Daa - синтезированный из D-аминокислот) последовательности N-конца белка vMIP-II, имеющий структуру LGASWHRPDK и обладающий активностью антагонистов рецептора CXCR4, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру КККККККК и присоединена к лигандной составляющей через спейсер - две молекулы ε-аминогексановой кислоты.

Все три варианта заявляемого носителя могут быть синтезированы с помощью известных методов пептидного синтеза, например твердофазным Вос-методом (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).

Примеры конкретной реализации

Изобретение поясняется с помощью фиг.1, на которой показано изменение интенсивности флуоресценции бромистого этидия при увеличении зарядовых соотношений носитель/ДНК в комплексах short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК. Падение интенсивности флуоресценции свидетельствует о возрастании плотности формировавшихся комплексов. Выход кривых флюоресценции на плато указывает на то, что комплексы достигли плотности, достаточной для гашения флуоресценции бромистого этидия.

На фиг.2 приведена зависимость активности люциферазы в клетках HeLa (CXCR4+) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. В этом случае использовали комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула, ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 (положительный контроль эксперимента - коммерческий носитель разветвленный полиэтиленимин 25 кДа - ПЭИ) и комплексы, содержащие ДНК и контрольный пептид (СР). СР отличается от носителей в настоящем изобретении отсутствием сигнала связывания с рецептором CXCR4 и по структуре представляет собой олиголизин КККККККК. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была в 10-100 раз выше, чем контролем СР.

На фиг.3 приведена зависимость активности люциферазы в клетках А172 (CXCR4+) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. Здесь использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 и комплексы, содержащие ДНК и пептид СР. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была в 10 раз выше, чем контролем СР.

Результаты на фиг.2 и фиг.3 свидетельствуют в пользу специфичности носителей в настоящем изобретении к рецептору CXCR4.

На фиг.4 показана зависимость активности люциферазы в клетках СНО (CXCR4-) после трансфекции комплексами short CDP/ДНК, long CDP/ДНК и viral CDP/ДНК в присутствии эндосомолитического агента глицерина. Использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 9/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 1/8 и комплексы, содержащие ДНК и пептид СР. Эффективность доставки маркерного гена носителями short CDP, long CDP и viral CDP была практически такой же, как с использованием контроля СР.

Носители с сигналом не способны обеспечить достоверно высокого по сравнению с контролем уровня доставки генетического материала в клетках без экспрессии рецептора.

Осуществление изобретения можно пояснить следующим образом. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении направленной доставки генетических конструкций в клетки с экспрессией рецептора CXCR4 с использованием носителей генетического материала, содержащих сигнальные последовательности к данному рецептору.

На первом этапе проводят образование комплексов одного из воплощений носителя с генетической конструкцией, содержащей ген "интереса". Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в соответствующие клетки-мишени. Анализ эффективности проникновения в клетки оценивают с помощью ферментативных или иммуногистохимических методов.

Формирование комплексов проводят в изотоническом растворе. Предпочтительным является бессолевой буфер НВМ (Hepes-buffered mannitol). Размер образующихся комплексов составляет 170-230 нм.

В качестве генетических конструкций в одном из воплощений используют плазмидную ДНК.

Плазмидная ДНК содержит в своем составе маркерный (luc, lacZ) или терапевтический ген (в зависимости от заболевания), под контролем соответствующих промоторов и энхансеров (CMV, SV40 и др.) и другие элементы, необходимые, например, для репликации в клетки-хозяине или интеграции в геном. При генотерапевтичеком лечении раковых заболеваний могут быть использованы гены HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, тимидинкиназы и проч.

В другом воплощении в качестве генетической конструкции используют олигонуклеотиды, состоящие из ДНК или РНК небольшого размера, комплементарные специфической последовательности в составе мРНК или ее предшественника для подавления синтеза белкового продукта или выбрасывания из мРНК экзона, несущего мутацию. Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в клетки с экспрессией рецептора CXCR4. Проникновение комплексов с носителем из настоящего изобретения происходит преимущественно с помощью рецептор-опосредованного переноса путем связывания с внеклеточными доменами рецептора CXCR4 и последующей интернализацией рецептора.

Доза носителей и генетического материала определяется индивидуально и зависит от типа клеток, количества рецептора CXCR4 на их поверхности и сложности трансфецирования данных клеток.

Для увеличения эффективности данных носителей трансфекцию клеток предпочтительно проводить с использованием эндосомолитического агента. К ним относятся глицерин, хлороквин и др. Данные вещества добавляют в среду трансфекции непосредственно перед внесением комплексов к клеткам. Они остаются несвязанными с комплексами, поэтому не влияют на их структуру.

В качестве ДНК-связывающей части носителя могут быть использованы пептиды, другие полимерные соединения, липосомы, которые способны к компактизации нуклеиновых кислот. Кроме того, они могут обладать эндосомолитическими свойствами (нет надобности в использовании дополнительного эндосомолитического агента) и в случае, когда это необходимо (например, для доставки терапевтических или маркерных генов), доставлять генетический материал в ядро.

При подборе условий трансфекции они создаются так, чтобы обеспечить наибольшую эффективность доставки. Предпочтительным является инкубация комплексов с клетками в течение 4 часов. Однако можно варьировать это время от 3 до 6 часов. По истечении времени инкубации производят смену среды и оставляют клетки на 24-48 часов (в зависимости от типа клеток и генетического материала) для экспрессии введенных конструкций с геном-интереса или проявления терапевтического эффекта олигонуклеотидов.

Анализ эффективности доставки проводится ферментативными или иммуногистохимическими методами в зависимости от типа введенной генной конструкции.

Пример 1. Формирование комплексов ДНК/носитель и изучение процесса комплексообразования.

В качестве генетического материала для направленной доставки генов в клетки была использована плазмида pCLUC4, содержащая ген люциферазы светляков под контролем промотора цитомегаловируса. Использовали одно из воплощений носителя.

Приготавливали растворы 1 мкг ДНК в 40 мкл 1X буфера НВМ (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) и растворы носителя, соответствующие различным зарядовым соотношениям ДНК/носитель, в равном объеме буфера. В пробирку-эппендорф с раствором ДНК постепенно добавляли раствор носителя и интенсивно перемешивали в течение 20 секунд. Полученную смесь оставляли на 30 минут при комнатной температуре для завершения процесса формирования комплексов.

Результаты по комплексообразованию анализируют методом вытеснения бромистого этидия. Измерение флуоресценции этидиум бромида производят с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Varioscan Flash (Thermo, Finland). Наблюдается вытеснение бромистого этидия при излучении 590 нм (возбуждение при 544 нм) после добавления носителя к ДНК (20 мкг/мл), преинкубированной с интеркалирующим агентом бромистым этидием (400 ng/ml). Вытеснение было посчитано по формуле (F-Ff)/(Fb-Ff), где Ff и Fb - это интенсивности флюоресценции бромистого этидия в отсутствие и присутствии ДНК соответственно Результаты представлены на фиг.1.

Пример 2. Проведение трансфекции in vitro.

Клетки культуры HeLa, A172 и СНО рассевали на культуральные 48-луночные планшеты (Nunc) за 24 часа до трансфекции из расчета 50000 клеток на лунку, содержащую 500 мкл стандартной культуральной смеси, состоящей из культуральной среды DMEM (GIBCO), 10% сыворотки эмбрионов коров (GIBCO), 2 мМ глютамина, с добавлением пенициллина (50 U/мл), стрептомицина (50 мкг/мл) и 1 мМ содиум пирувата. Суспензию комплексов приготавливали согласно методике, описанной в примере 1 из расчета 2 мкг ДНК на каждую лунку культурального планшета. За 10 минут до внесения суспензии комплексов ДНК/носитель клетки несколько раз промывали средой DMEM и вносили в каждую лунку по 500 мкл среды, содержащей 15% глицерин и 1,5% этанол. Трансфекцию проводили путем добавления суспензии комплексов ДНК/носитель в среду. После внесения комплексов планшеты с клетками помещали в термостат с температурой 37°С и 5% содержанием CO 2 на 4 часа. По прошествии времени инкубации клетки промывали средой DMEM и вносили в каждую лунку по 500 мкл стандартной культуральной смеси. Культуральный планшет инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% содержанием СО 2 в течение 48 часов, после чего проводили выявление экспрессии маркерного гена.

Пример 3. Выявление экспрессии гена люциферазы после трансфекции in vitro.

Удаляли среду из культуральных планшетов, промывали клетки в 1х PBS (рН 7.2). В каждую лунку добавляли по 80 мкл лизис буфера (25 MM Gly-Gly, 15 мМ MgSO 4 , 4 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF; pH 7.8). По 50 мкл лизата переносили в полистироловые планшеты с непрозрачными стенками для измерения активности люциферазы. Измерение проводили с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Varioscan Flash (Thermo, Finland). Измерение проводили с использованием раствора luciferase flash mix (20 мМ Tricine, 1.07 мМ (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 мМ MgSO 4 , 0 1 мМ EDTA, 33.3 мМ DTT, 530 мкМ АТР, 270 мкМ ацетил коэнзима А, 470 мкМ люциферина). Каждое измерение выполнялось в течение 10 секунд. Показания прибора получали в относительных световых единицах (RLU). Результаты эксперимента оценивали в относительных световых единицах на 1 мг тотального белка из клеточных экстрактов в лунке культурального планшета. Общее количество белка в каждой лунке измеряли с помощью protein assay kit (Bio-Rad), относительно калибровочной кривой по бычьему сывороточному альбумину. Результаты представлены на фиг.2, 3, 4.

Одним из наиболее перспективных вариантов систем доставки генов в клетки являются полиплексы – комплексы переносимой ДНК и катионных полимеров различной природы. В данной статье описываются свойства полиплексов на основе нескольких типов катионных полимеров, их транспорт в ядра клеток-мишеней, а также один из подходов для лечения злокачественных новообразований с помощью этих конструкций.

Введение

Генная терапия – лечение наследственных, онкологических и других заболеваний путём внесения в клетки пациента необходимого генетического материала с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций [Горбунова и др., 1997]. Для доставки ДНК или РНК в клетки-мишени создаются носители (векторы) для обеспечения высокого уровня трансфекции, т.е. переноса экзогенной (чужеродной) ДНК или РНК в определённые типы клеток. Помимо этого, векторы должны обеспечивать защиту генетической информации, т.к. в условиях in vivo чужеродная ДНК нестабильна из-за быстрой деградации сывороточными нуклеазами , ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты.

Типы транспортёров генетического материала

В природе существуют специализированные структуры для доставки генетической информации в клетки – вирусы. Поэтому их начали использовать в качестве транспортёров генов. В то же время использование вирусных векторов имеет целый ряд ограничений. Во-первых, это малая ёмкость переносимого генетического материала и свойственная вирусам собственная клеточная специфичность. Во-вторых, это возможность вирусов возвращения к дикому типу в результате рекомбинации при прохождении однотипной инфекции. В-третьих, белки вирусных частиц обладают высокой иммуногенностью, в результате чего повторное их введение вызывает иммунный ответ. Наконец, массовое производство вирусных векторов всё ещё достаточно проблематично и требует больших затрат. В настоящее время активно разрабатываются различные варианты невирусных носителей на основе катионных липидов и катионных полимеров. Эти катионные молекулы способны спонтанно формировать самособирающиеся нанокомплексы с отрицательно заряженной молекулой ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Самособирающиеся комплексы, состоящие из катионных липидов и ДНК, называют липоплексами, состоящие из катионных полимеров и ДНК – полиплексами.

Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов

Для целей генотерапии и биотехнологии предложено большое количество катионных полимеров или поликатионов. Поликатионы конденсируют ДНК в компактные нанокомплексы, обеспечивая стабильность ДНК и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связывающих полимеров могут служить катионные белки, синтетические гомополимеры аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленимин, дендримеры различного состава и другие модифицированные полимеры . Степень компактизации ДНК определяется суммарным зарядом комплекса, который, в свою очередь, зависит от отношения количества положительных групп полимеров к числу отрицательных фосфатных групп ДНК. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке, в результате чего формируются наноразмерные комплексы (от нескольких десятков до нескольких сотен нм), которые растворимы в воде и положительно заряжены (рис. 1, 2). В противном случае комплексы будут нестабильны.

Рис. 1. Схема образования полиплексов из катионных полимеров и кольцевой молекулой ДНК (плазмидой) . Рис. 2. Изображение полиплексов на подложке, полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (деление шкалы 200 нм), .

Одним из первых применяемых для доставки генов поликатионов был поли-L-лизин (ПЛ, рис. 3), который благодаря своей пептидной природе является биодеградабельным, что делает его крайне удобным для использования in vivo. Часто для устранения нежелательных эффектов, связанных с высокой плотностью поверхностного заряда, применяют сополимер ПЛ с полиэтиленгликолем (ПЭГ), . В результате такой модификации уменьшается поверхностный заряд комплекса, что предотвращает неспецифическую адсорбцию отрицательно заряженных сывороточных белков крови на полиплексах, а также уменьшает цитотоксичность комплексов.

Полиэтиленимин (ПЭИ, рис. 3) считается одним из наиболее перспективных вариантов поликатионов для создания полиплексов на его основе. ПЭИ синтезируют в двух формах: линейной и разветвлённой. ПЭИ обладает большим количеством амино- и иминогрупп, способных к протонированию, в результате чего он проявляет буферные свойства при физиологических условиях. Полиплексы на основе ПЭИ отличаются более эффективной трансфекцией и защитой от действия нуклеаз по сравнению с другими поликатионами, что связано с высокой плотностью зарядов на ПЭИ и более компактным сворачиванием ДНК. Сильный положительный заряд приводит к токсичности ПЭИ, что вместе с отсутствием биологического разложения ПЭИ являются лимитирующими факторами для использования ПЭИ in vivo. С целью снижения цитотоксичности ПЭИ модификацируют с помощью полиэтиленгликоля, обладающего низкой токсичностью и высокой гидрофильностью.

Рис. 3. Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов, и .

Другим представителем поликатионов, используемых в доставке генетической информации являются полиамидоамины (ПАМАМ, рис. 3). Эти соединения представляют собой сильноветвящиеся дендримеры. Благодаря ветвлению ПАМАМ обладают большой гибкостью, в лучшей степени компактизуют ДНК, полиплексы на их основе более стабильны, чем все остальные, . По своим свойствам имеет много общего с ПЭИ.

Хитозаны (рис. 3) представляют собой полисахариды, построенные из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных (1>4) гликозидными связями. В зависимости от молекулярного веса и степени деацетилирования хитозаны формируют стабильные комплексы различной величины с переносимой ДНК. Маленькие, или наоборот, слишком большие полимеры хитозана ведут к снижению экспрессии переносимого гена. Основным достоинством полиплексов на основе хитозана является биодеградабельность, .

На эффективность доставки полиплексов влияют многие факторы: молекулярный вес, степень разветвленности, полимеризации и тип полимера, размер частиц, ионная сила раствора, поверхностные заряды комплексов, а также условия проведения эксперимента. Оптимальный подход должен учитывать каждый из этих факторов и их влияние на свойства комплекса, поглощение клетками-мишенями комплексов, токсичность.

Существуют несколько подходов для обеспечения специфичности действия полиплексов на клетки-мишени. Один из них включает в себя адресную доставку нанокомплексов в определённые типы клеток. Этот подход связан с присоединением к полиплексам компонентов (лигандов), рецепторы к которым в большом количестве присутствуют на поверхности клеток-мишеней. В качестве специфичных лигандов используются различные белки, сахара, пептиды, антитела и т.д. Другая стратегия заключается в использовании таких транспортируемых генов, которые были бы активны только в определённых клетках, при этом доставка комплексов происходит неспецифично, то есть в любые клетки.

Проникновение полиплексов в клетки-мишени

Процесс доставки генетического материала включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения до клеток-мишеней) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишенями, эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Внутриклеточные пути транспорта полиплексов представлены на рисунке 4.

Первым барьером, который необходимо преодолеть полиплексу на пути до клетки-мишени является кровь и внеклеточный матрикс. Именно поэтому необходимо подобрать такие физико-химические параметры комплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать неспецифических взаимодействий и возможности иммунного ответа. Во-первых, в составе полиплекса ДНК должна быть защищена от действия внеклеточных нуклеаз. Во-вторых, отрицательно заряженные белки сыворотки крови (альбумин, фибриноген, иммуноглобулины и др.), а также белки внеклеточного матрикса (коллагены) способны адсорбироваться на поверхности заряженных нанокомплексов, что ведет за собой изменение поверхностного заряда полиплексов, приводит к увеличению размера комплексов и к их агрегации. При введении полиплексов в организм они частично накапливаются в тканях и подвергаются фагоцитозу. По этим причинам часто применяют местное введение полиплексов (например, в опухоль при раке) в расчёте на их неспецифическое взаимодействие с клетками ткани.

Рис. 4. Внутриклеточные пути транспорта полиплексов, .

Полиплексы сначала адсорбируются на плазматической мембране, поглощаются путём эндоцитоза, после чего они должны покинуть эндолизосомы и пересечь ядерную оболочку для попадания в ядро. Существуют также альтернативные пути транспорта, не всегда приводящие к доставке комплексов в ядро. Помимо этого, для экспрессии переносимого гена необходима диссоциация полиплекса на катионный полимер и свободную ДНК.

Следующим этапом доставки генетического материала в клетки-мишени является их взаимодействие с плазматической мембраной и поглощение клеткой. Как было отмечено выше, связывание полиплексов с клетками в отсутствие лиганда происходит неспецифично в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной плазматической мембраной. В большинстве случаев такие полиплексы поглощаются путём неспецифического адсорбтивного эндоцитоза . При включении лиганда в состав комплекса можно добиться поглощения с помощью клатрин-зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза . Другие пути захвата зависят от типа клеток и включают в себя фагоцитоз и кавеолин-зависимый эндоцитоз. Одна из стратегий для улучшения доставки полиплексов в клетку включает в себя использование вирусных проникающих пептидов, таких как TAT-пептид, впервые выделенный из вируса ВИЧ-1. Использование этих последовательностей обеспечивает попадание конструкций в клетку, и доставку полиплексов в клеточное ядро.

Одним из самых важных этапов транспортного пути полиплексов является их выход из эндосом. Как известно, эндосомы представляют собой систему трубочек и пузырьков, что необходимо для сортировки поглощённых макромолекул. Сортирующие эндосомы расположены ближе к плазматической мембране . За счёт работы протонных помп в них понижается рН (около 6,5 в сортирующих эндосомах). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощённых молекул во внемембранное пространство, либо по литическому пути, когда происходит дальнейшее закисление среды в поздних эндосомах, и макромолекулы поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активируются при низком рН. Продукты деградации удаляются из клетки путём экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал.

Считается, что полиплексы на основе ПЭИ в силу своих свойств способны выходить из эндосом благодаря так называемому эффекту «протонной губки» (proton sponge effect). Эта гипотеза основана на том, что катионные полимеры за счёт наличия непротонированных вторичных и третичных аминов создают буферный эффект, в результате чего H±АТФаза, накачивающая протоны в эндосомы, начинает работать активнее. При этом происходит накопление внутри эндосом анионов хлора. В результате из-за резкого увеличения осмотического давления происходит набухание и лизис, что позволяет полиплексам попасть в цитозоль неповреждёнными. Предложен и другой механизм выхода из эндосом для полиплексов, который заключается в дестабилизации эндосомальной мембраны из-за высокой поверхностной плотности заряда нанокомплексов . Комплексы на основе ПЛ и хитозана не вызывают эффекта «протонной губки» и в меньшей степени способны дестабилизировать мембрану эндосом, что приводит к гораздо меньшей эффективности трансфекции.

Выйдя из лизосом, полиплексы оказываются в перинуклеарном пространстве, после чего комплекс диссоциирует на свободный поликатион и ДНК. Считается, что это происходит за счёт конкуренции за катионные группы между фосфатными группами ДНК и низкомолекулярными соединениями и анионами цитоплазмы. В некоторых случаях диссоциация комплекса происходит, по-видимому, в ядре. Главным барьером на пути плазмидной ДНК в клеточное ядро служит двойная ядерная оболочка. Для доставки в ядро макромолекул в их состав включают последовательность ядерной локализации (ПЯЛ), которая в комплексе с?- и?-импортинами будет узнаваема ядерным поровым комплексом (ЯПК) и активно проникать внутрь ядра. Через ЯПК путём пассивной диффузии могут проходить только маленькие молекулы (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Механизмы действия терапевтических генов

После проникновения плазмиды в ядро начинается экспрессия терапевтического гена. Для придания специфичности действия полиплексам терапевтический ген в составе плазмиды ставится под контроль промотора (область гена, на которую садится РНК-полимераза перед транскрипцией), активного только в опухолевых тканях. Примерами могут служить промотор гена антиапоптозного белка сурвивина или гена фермента теломеразы. В качестве терапевтического гена может быть использован ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk), которая обладает способностью фосфорилировать антигерпесные соединения ацикловир и ганцикловир . Эти соединения вводятся в опухоль спустя некоторое время. Далее клеточные киназы (фосфорилирующие ферменты) превращают фосфорилированные ацикловир или ганцикловир в трифосфаты, которые способны включаться во вновь синтезированную ДНК во время удвоения при клеточном делении и терминировать её синтез. В результате клетки, в ядра которых попал ген тимидинкиназы, уничтожаются в присутствии этих веществ. При этом погибают именно делящиеся клетки, а не покоящиеся, которые не синтезируют ДНК и не включают ганцикловир или ацикловир. Такой механизм действия терапевтического гена можно использовать для целей генной терапии раковых опухолей, клетки которых быстро делятся.

Список литературы:

1. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Пб., «Специальная литература», 1997, с.287.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery. //Nucl. Acids. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Current status of polymeric gene delivery systems. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467– 486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. and Stayton P. S. Design and development of polymers for gene delivery. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4, 581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G. L. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755– 767.
6. Maxfield F.R. and McGraw T.E. Endocytic Recycling. // Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, vol. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. and Topal M.D. Insertion and extension of acyclic, dideoxy, and ara nucleotides by herpesviridae, human alpha and human beta polymerases. // J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.

Дурыманов Михаил , студент Биологического факультета МГУ

Статья – призер научно-популярного конкурса на конференции «Ломоносов 2009» (Биологический факультет, секции «Нанобиотехнология», «Биоинженерия», «Биофизика».

ДНК-вакцина (также генная вакцина, вакцина на основе нуклеиновых кислот) — генно-инженерная конструкция, которая после введения в клетку обеспечивает выработку белков патогенов или опухолевых антигенов и вызывает иммунную реакцию. Введение ДНК-вакцин в организм называют генетической иммунизацией. ДНК-вакцинация имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными вакцинами. В частности показано, что такие вакцины обеспечивают не только выработки антител (гуморальный иммунитет), но и специфическую цитотоксическую ответ (клеточный иммунитет), ранее было достижимым только с помощью живых вакцин. Сегодня ДНК-вакцины не применяют для лечения человека, однако прогнозируется, что генетическая иммунизация поможет преодолеть целый ряд заболеваний.

История создания

Идея использовать фрагменты ДНК для вакцинации появилась в 50-60-е годы. После серии опытов было выяснено, что генетическая информация ДНК сохраняет способность транскрибироваться и транслироваться после переноса в другую клетку. В том же году обнаружили, введение животным генома вируса полиомиелита стимулирует выработку антител. Позже активацию гуморального иммунитета показали для молекул ДНК, полученных из неинфекционных агентов. Начиная с 90-х годов научные лаборатории начали все активнее исследовать иммуностимулирующие свойства ДНК. В 1992 году Танг вместе с коллегами показал, что ген гормона роста человека, встроенный в плазмиду, стабильно экспрессируется в организме мыши, а синтезированный гормон распознается иммунной системой как антиген и стимулирует выработку антител. Процесс ввода плазмидной ДНК для стимуляции гуморального иммунитета был назван Танго »генетическая иммунизация». Однако уже в следующем году другая группа ученых заявила, что введение плазмиды, кодирующей белки вируса гриппа, вызывает как гуморальный, так и клеточный ответ. Индукции обеих ветвей иммунитета того же года обнаружили и для плазмиды, содержащей гены ВИЧ. С 1995 года начали появляться данные, что ДНК-вакцинация способна активировать иммунную систему против раковых заболеваний. Около 20 лет назад состоялись первые клинические испытания ДНК-вакцин, которые в первую очередь должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Пациентам вводили гены ВИЧ, вируса гриппа, герпеса, гепатита B, возбудителя малярии. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: ДНК-вакцины стабильно експресувались, провоцировали иммунный ответ и не вызывали серьезных побочных эффектов, что послужило толчком для их дальнейшего исследования.

Конструирование ДНК-вакцины

По структуре ДНК-вакцина — это встроенная в вектор нуклеотидная последовательность, кодирующего определенный антиген или антигены. Вектором в генной инженерии называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая служит для доставки генетического материала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Ранее для транспортировки генов в клетку применяли векторы на основе вирусов: модифицированного (ослабленного) вируса натуральной оспы, аденовирусов и ретровирусов. Вирусные векторы являются достаточно эффективными, однако имеют значительную вероятность развития побочных эффектов, связанную с относительно высокой иммуногенностью самого вектора. Поэтому на сегодня в качестве вектора чаще используют бактериальную плазмиду — небольшую стабильную кольцевую молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Сама по себе плазмида не вызывает нужной специфического иммунного ответа, для этого у нее вшивают гены иммуногенных белков. Также ДНК-вакцина должна содержать регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот. Готовую ДНК-конструкцию доставляют в бактериальную клетку, где наращивается количество ее копий. После этого проводят выделения и очистки плазмид, которые несут нужную вставку.

Дизайн плазмидного вектора

Важным этапом создания ДНК-вакцин является дизайн (конструирование) вектора. Обязательными структурами плазмидного вектора есть сайты рестрикции, селективный маркер и точка начала репликации ДНК-вакцины в бактериальной клетке. Чтобы осуществлялся синтез антигена, ДНК-вакцина должна содержать промотор и сигнал полиаденилирования. Промотор является важным фактором эффективности вакцины, поскольку определяет силу иммунного ответа: чем больше экспрессия гена, кодирующего вирусный или опухолевый антиген, тем сильнее иммунный ответ. Чаще всего используют промотор вируса SV40 или цитомегаловируса (CMV). Для стабилизации мРНК-транскриптов в плазмиду встраивают сигнал полиаденилирования, чаще всего, полученный из гена гормона роста быка (BGH) или вируса SV40. В качестве селективных маркеров выбирают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, часто это ген устойчивости к канамицину. При конструировании ДНК-вакцин наиболее популярна точка начала репликации Escherichia coli.

Выбор гена для иммунизации

Вектор является важным компонентом ДНК-вакцины, однако ее иммуногенность определяется именно вставкой — последовательностью ДНК, кодирующей антиген. Среди вирусных антигенов для иммунизации лучше всего подходят белки слияния — это относительно консервативные белки, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку. Для вакцинации против грамположительных бактерий в плазмидный вектор целесообразно встраивать гены тех бактериальных белков, которые определяют патогенез заболевания. Среди белков грамотрицательных бактерий высокую имунногенисть имеют погрузится. Для терапевтических противоопухолевых ДНК-вакцин используют белки-маркеры раковых клеток.

Способы доставки ДНК-вакцин в клетку

Готовую вакцину нужно доставить в организм человека или животного, где ее точка назначения — антиген-презентуя клетки (АПК) — макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты. Здесь будет происходить синтез и посттрансляционной модификации антигенной, после чего он будет встроен в мембрану клетки, чтобы привлечь внимание иммунной системы. Основа проблема заключается в доставке достаточного количества плазмиды в АПК. Методы доставки генетического материала в клеточную разделяют обычно на 2 группы: вирусные и невирусные. Поскольку вирусные векторы имеют ряд существенных недостатков, в данном разделе представлены только невирусные методы доставки ДНК-вакцин.

Микроинъекция

В начале 1990-х для ввода ДНК в клетку наиболее распространенным были внутримышечные микроинъекции, что обусловлено простотой метода. Для этого ДНК растворяют в воде или изотоническом растворе, при необходимости добавляют адъювант (вещество, усиливающее иммунный ответ). Далее с помощью тонкой стеклянной трубки раствор вводят в мышечную ткань, где роль АПК выполняют дендритные клетки. Попав в ядро ​​дендритной клетки вакцина начинает экспрессироваться и происходит синтез белков-антигенов. С помощью микроинъекций ДНК можно вводить подкожно, в тимус, печень, опухолевую ткань, однако именно в мышечной ткани наблюдается наиболее длительная (до года) экспрессия ДНК-вакцины. Благодаря высокой концентрации клеток Лангерганса (подтип дендритных клеток), привлекательной мишенью для ДНК-вакцинации является кожа. Для интрадермального (подкожного) введения используют массив с микроигл, длина которых несколько сотен микрон. Существуют различные варианты интрадермальном вакцинации. Проще включая разрыхления массивом микроигл рогового слоя кожи (внешний слой кожи, обычно 10-20 мкм), чтобы увеличить ее проницаемость для дальнейшего местного введения раствора ДНК. Более эффективным является использование микроигл, покрытых сухой вакциной, которая растворяется уже под кожей. Эффективность этого метода обычно низкая, поскольку сначала ДНК попадает в межклеточное пространство, а уже потом включается в клетки.

Электропорация

Электропорация — традиционный подход для доставки ДНК в бактериальные клетки и культуры клеток, основанный на применении электрического импульса. Такой импульс создает поры в клеточной мембране, что способствует вхождению отрицательно заряженной ДНК. Этот способ был заимствован для доставки ДНК-вакцины в организм животных и человека и позволяет значительно повысить эффективность обычной инъекции. Прибор для электропорации содержит источник электрического тока и одноразовую сетку, которая состоит из шприца и игл-электродов. Шприц вводит вакцину в мышечную ткань, а электроды создают электрическое поле, которое облегчает вхождение ДНК в миоциты и дендритные клетки. На сегодня разработаны устройства, которые позволяют повысить эффективность вакцинации в 1000 раз по сравнению с обычной инъекцией. Электропорации можно применять как для внутримышечного, так и для подкожного введения ДНК-вакцины. Недостатками являются незначительная болезненность в месте инъекции, потребность в специализированных устройствах. Вместо электрического поля можно использовать магнитное. Такие устройства действуют по тому же принципу, однако в этом случае процедура полностью безболезненной и менее повреждает клетки.

Действие электрического поля не только усиливает поглощение ДНК-вакцины клетками, но и стимулирует выработку иммунного ответа. Применение электропорации приводит к незначительному повреждению ткани — развивается локальный воспалительный процесс. Повреждении клетки выделяют хемокины, поэтому к ним направляются макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Увеличение концентрации иммунных клеток в месте введения вакцины повышает ее эффективность.

Сонопорация

Сонопорация — метод переноса чужеродной ДНК в клетки с помощью ультразвука. Ультразвук увеличивает проницаемость клеточной мембраны, вследствие чего экзогенная ДНК легче проникает в клетку. Впервые сонопорация для переноса генов в клетку была применена в 1986 году. Этот метод применяется для ввода молекул ДНК в клетки роговицы, мозга, костной ткани, почек, поджелудочной железы, эмбриональной ткани, скелетных и сердечной мышц. Относительно других методов сонопорация является малоисследованной, необходимо еще немало усилий, чтобы повысить ее эффективность, особенно на уровне целого организма.

Баллистическая трансфекция

Баллистическая трансфекция основывается на обстреливания (бомбардировке) органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам) диаметром 1-3 мкм покрытых молекулами ДНК. Введена таким образом ДНК-вакцина экспрессируется в клетках-мишенях, а их продукты попадают в кровь. Для предоставления ускорение частицам используются похож на стрелковое оружие устройство — генный пистолет или генную пушку. Микрочастицы проходят через клеточные мембраны и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядро ​​клетки. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика — до 1 мм, поэтому метод применяют преимущественно для трансфекции кожи или прилегающей хрящевой ткани. Особые условия обстрела позволяют микрочастицам проникать на глубину до 4-5 мм и переносить генные конструкции в волокна поперечно-полосатых мышц. Обычно клетки, находящиеся непосредственно по центру выстрела, погибают, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформовани клетки. Эту технологию называют также биобалистикою или биолистикою.

Первый генный пистолет был создан группой ученых в период 1 983 и 1 986 годами с целью трансформации клеток растений. Это был пистолет, разработанный на основе устройства, для автоматического забивания гвоздей. На вольфрамовую шар наносили ДНК с репортерного (маркерным) геном и выстреливали ней в чашку Петри. Экспрессия репортерного гена свидетельствовала об эффективности иммунизации. На сегодня для доставки ДНК используют частицы из золота или серебра, так как они являются не токсичен для клетки, в отличие от вольфрамовых.

Под действием высокого давления

В 1999 году были разработаны инъекционные приборы, которые способны вводить ДНК-вакцину без использования иглы. Такие устройства работают благодаря силе Лоренца: небольшой мощный магнит создает значительное давление, проводит в действие поршень, который выбрасывает лекарственный препарат со скоростью звука. Изменяя силу тока можно выбирать глубину инъекции и дозировать лекарства. Процедура совершенно безболезненна и раньше использовалась для введения инсулина больным диабетом и при проведении масштабных вакцинаций. Существенным недостатком этого метода является то, что высокое давление теоретически может изменять структуру молекул, которые вводятся. Тем не менее, данную технологию введения продолжают совершенствовать, и на сегодня разработаны приборы, которые могут доставить ДНК на глубину до 16 мм.

В составе живого бактериального вектора

Живые бактериальные векторы — это штаммы Salmonela, Shigella или Listeria, которые несут мутацию в генах биосинтеза или инвазии, что устранение патогенность и способность сохранять свою жизнеспособность в организме хозяина или окружающей среде. Зато в геном бактерий встраивают нужные гены иммуногенных протеинов. Ослабленная бактерия вводится в организм пероральным путем (через рот, путем проглатывания) или интроназально (путем впрыскивания в носовое отверстие), поэтому этот способ вакцинации не требует ни оборудования. Кроме того, такое введение стимулирует иммунный ответ слизистой оболочки, важно, поскольку большинство патогенов попадают в организм через ротовое и назальный отверстия. Минуя желудок ослаблена бактерия попадает в тонкий кишечник. Далее бактерия проникает в Пеер бляшки — лимфоузлы кишечника. Оказавшись в середине пейеровы бляшек, бактерии становятся мишенью для макрофагов и подвергаются фагоцитозу. В цитоплазме макрофага происходит высвобождение бактерией ДНК-вакцины, после чего ДНК попадает в ядро, а бактерия обезвреживается иммунной системой.

Упаковка в липосомы

Липосома — шаровидные образования (около 100 нм в диаметре), состоящий из двойного липидного слоя. Липосомы полые внутри, которая обычно заполнена растворителем, но может использоваться для доставки различных веществ, в том числе и ДНК-вакцин. Их гидрофобный оболочка позволяет им сливаться с клеточными мембранами и переносить свое содержимое внутрь клетки. Использование липосом началось в 1965 г.., И это стало мощным двигателем развития бионанотехнологий.

Перспективным способом прямого ввода ДНК конструкции в клетки-мишени является доставка генетической конструкции в составе катионных липосом, построенных из положительно заряженных липидов. Катионные липосомы с отрицательно заряженной молекулой ДНК образуют ДНК-липидный комплекс — липоплекс. Преимущества применения таких комплексов — способность нести большой объем информации, неинфекцийнисть, кроме того, они просты и недороги в изготовлении. В 2003 были созданы чрезвычайно малы — милимикронни липосомы покрыты полимером полиэтиленгликолем, которые способны проносить терапевтическую ДНК через гематоэнцефалический барьер и доставлять ее в нейроны головного мозга, до этого было невозможным.

В составе полиплекс

Для введения в клетку ДНК-конструкций больших размеров (> 10 т.п.н.) используют полиплекс — системы, состоящие из положительно заряженных полимеров (поликатионив) и отрицательно заряженных молекул ДНК. Размер таких комплексов составляет менее 100 нм, что, с одной стороны, чем подвергает их на переваривание макрофагами (так они реагируют на частицы более 200 нм), а с другой стороны, они достаточно большие, чтобы не фильтроваться в почках.

Поликатионы конденсированных молекулу ДНК в комплексы, таким образом обеспечивают ее стабильность и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связывающий полимеров могут служить катионные белки, синтетические гомополимера аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиетиленамин. Обычно в составе полиплекс поликатион находится в избытке, в результате чего данный комплекс является растворимым и положительно заряженным. Если к полиплекс пришить лиганд к определенному клеточного рецептора, то ДНК-вакцину можно направлять в конкретный тип клеток. Процесс доставки генетического материала в составе полиплекс включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения к клеткам-мишеням) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишеней, эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Первым барьером, который необходимо преодолеть комплекса, является кровь и внеклеточный матрикс. Поэтому подбираются такие физико-химические параметры полиплекс, чтобы увеличить его стабильность, избежать нежелательных взаимодействий с белками крови и иммунной реакции, вызванной химической природе поликатиону. Попав в клетки-мишени, полиплекс абсорбируется на плазматической мембране, поглощается путем эндоцитоза, после чего он должен покинуть эндосом и диссоциировать на катионный полимер и молекулу ДНК. Свободная ДНК направляется в ядро, а катионы полимер покидает клетку и выводится из организма.

Механизм развития иммунного ответа

Синтезированный в клетке антиген подвергается процессингу, после чего происходит его презентация иммунокомпетентных клеток. Процессинг — это расщепление антигенного протеина на иммуногенные пептидные фрагменты. Презентация означает подачу фрагмента антигена соединенного с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) иммунокомпетентных клеток. Различают два наиболее значимых класса этих молекул: МНС класса I (МНС-I) и МНС класса II (МНС-II). Для связывания с молекулами каждого класса антиген проходит подготовку в специализированных компартментах клетки. Эндогенные белки-антигены направляются на деградацию в протеасому, после чего представляются в комплексе с МНС-I на поверхности клетки. Здесь при встрече их распознают CD8 + T-клетки (Т-киллеры), которые реализуют цитотоксическое иммунный ответ. Экзогенные белки расщепляются лизомнимы протеазами, включаются в состав MHC-II и распознаются рецепторамиCD4 + Т-клеток (Т-хелперов). Последние вызывают как клеточную, так и гуморальный ответ.

Презентация антигена по пути МНС-I

ДНК-вакцинация предусматривает эндогенный синтез антигена, поэтому этот путь является преобладающим. Процессинг антигена по пути МНС-I проходит в несколько этапов. Синтезирован в ядре белок транспортируется в цитоплазму, расщепляется Протеасома на короткие пептиды — эпитопы, которые специальными белками-транспортерами антигенов (ТАР, transporter associated with antigen processing) переносятся в эндоплазматический ретикулум (ЭПР). В ЭПР каждый эпитоп сочетается с молекулой MHC-I, после чего образованный комплекс направляется в аппарат Гольджи (АГ) на гликозилирования. Оттуда комплекс в составе везикулы стремится к плазматической мембраны. После слияния везикулы с плазмалемме комплекс оказывается на поверхности клетки, где распознается рецепторами Т-киллеров, которые обладают цитотоксической активностью.

Презентация антигена по пути МНС-II

Основным источником пептидов, связываются с МЧС-II являются экзогенные белки, которые попали в клетку с помощью эндоцитоза. Однако показано, что некоторые внутриклеточные белки также могут быть представлены в комплексе с МЧС-II. При этом новосинтезированные белки после попадания в цитоплазму переносятся в лизосомы, где антиген расщепляется под действием кислых протеаз. После этого лизосома, содержащий эпитопы, сливается с везикулой, которая несет молекулу МЧС-II. Внутри объединенной везикулы образуется комплекс эпитоп-МЧС-II, после слияния везикулы с плазмалемме выносится на поверхность клетки. Здесь этот комплекс распознается рецепторами Т-хелперов, в результате чего происходит их активация. Это приводит к стимуляции как клеточного (активация Т-киллеров), так и гуморального иммунитета (активация В-лимфоцитов).

Традиционная вакцинация растворимыми белковыми антигенами нацелена на мобилизацию T-хелперов. Сравнительно низкая ответ Т-хелперов является одним из недостатков ДНК-вакцин. Также нынешнее поколение ДНК-вакцин не способно индуцировать продукцию высоких титров антител. Чтобы повысить активацию Т-хелперов, антиген нужно перенаправить на путь МЧС-II. Для этого в ДНК-вакцину встраивают сигнал лизосомной локализации синтезированный антиген будет направляться в лизосомы, а значит ступать на путь МЧС-II

Стратегии повышения эффективности ДНК-вакцины

Главный вопрос относительно будущего ДНК-вакцин касается повышения их эффективности. В настоящее время проводится большое количество исследований, посвященных оптимизации разработанных ДНК-вакцин. Поиск решения ведется в двух направлениях: повышение экспрессии вакцины и увеличение иммуногенности закодированного антигена.

Оптимизация транскрипционных элементов

Важным компонентом ДНК-вакцины промотор. Бактериальные промоторы не подходят для экспрессии антигенной в клетках млекопитающих, поэтому вместо них использовали промоторы онкогенных вирусов. Сейчас для повышения безопасности вакцин их заменили на промоторы от неканцерогенных объектов, например, человеческого цитомегаловируса (CMV). Для большинства ДНК-вакцин этот промотор является оптимальным выбором: он характеризуется высокой экспрессией в широком диапазоне клеток. Для экспрессии гена в конкретных тканях, перспективным является использование промоторов, специфических для этого типа тканей. Например, использование промотора мышечной КФК при м введении приводит к десятикратного увеличения синтеза антител и индукции Т-клеточного ответа, чем использование аналогичной ДНК-вакцины с CMV промотором. Также высокую эффективность в миоцитах показал промотор гена десмина, кодирующего один из белков цитоскелета. Для повышения экспрессии ДНК-вакцины в кератиноцитах (клетки эпителиальной ткани) используют промоторы гена металотионеину (белок, связывающий тяжелые металлы) или гена гидроксилазы витамина D 3.

Уровень инициации транскрипции, как правило, повышается за счет использования мощного промотора и энхансер, а особенности терминации могут стать ограничивающим фактором. Эффективность полиаденилирования и процессинга первичного РНК-транскрипта меняется в зависимости от последовательности polyA-сигнала. То есть, последовательность полиаденилирование влияет на синтез антигена. Например, широко используемый polyA-сигнал вируса SV40 имеет меньшую эффективность чем сигнал полиаденилирования гена β-глобина кролика или гена гормона роста быка.

Для эффективной трансляции мРНК млекопитающих должна так называемую последовательность Козак. Вставка этой последовательности в ДНК-конструкцию может существенно увеличивать уровень синтеза антигена. Чтобы РНК-полимераза НЕ проскочила стоп-кодон гена и не состоялся синтез удлиненного протеина, который не сможет потом приобрести правильной укладки, ген можно заканчивать двойным стоп-рубежом.

При конструировании ДНК-вакцины также пытаются оптимизировать ее кодоны. Процедура оптимизации означает замену кодонов в последовательности гена таким образом, чтобы аминокислотная последовательность белка без изменений, но увеличивалась эффективность трансляции его мРНК. Причиной является то, что большинство аминокислот кодируются более чем одним рубежом. Каждый кодон имеет свою тРНК и представленность различных тРНК в клетке неодинакова, причем она также варьирует в зависимости от вида организма. Кодоны подбирают таким образом, чтобы наличие нужной тРНК при синтезе антигена не стала лимитирующим фактором.

Оптимизация антигена

Хотя сила иммунного ответа коррелирует с уровнем экспрессии ДНК-вакцины, однако для каждого антигена существует определенное плато, после которого увеличение количества антигенного протеина повышать продукцию антител. В то же время, достичь более сильной иммунной реакции можно за счет оптимизации антигена. Например, путем объединения антигена с лигандом к определенному рецептора антиген-презентуя клетки. Таким лигандом может быть маркерный белок CD40, внеклеточный домен Fms-образной тирозинкиназы-3 или антиген-4 Т-киллеров. За счет взаимодействия лиганд-рецептор повышается эффективность захвата антигенного протеина АПК.

Облегчение деградации антигена в Протеасома или лизосома также стимулировать иммунную реакцию. Для усиления протелиотичного расщепления антигена, в его последовательность встраивают сигнал убиквитинування Ошибка цитирования: Неправильный вызов: тег ref без названия должен иметь входные данные. Использование ДНК-вакцин, кодирующие вместо целого антигена, несколько эпитопов различного происхождения, позволяет значительно расширить спектр иммунного ответа.

Для противоопухолевых ДНК-вакцин эффективна комбинация «опухолевый антиген + вирусный или бактериальный антиген». Например, сочетание опухолевого антигена с эпитопом токсина столбняка значительно повышает активацию Т-киллеров против раковых клеток.

Включение адъювантов

При применении традиционных вакцин для повышения иммунного ответа к ним добавляют адъюванты. ДНК-вакцина имеет бактериальное происхождение, поэтому она сама является иммуностимулятором. Для усиления иммунного ответа в ДНК-вакцину встраивают гены адъюванта или применяют дополнительную плазмиду, которая кодирует иммуностимулирующие белки.

Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов

Функция плазмиды не ограничивается доставкой генов в клетки. Еще в 1893 году было обнаружено, что смесь бактериальных лизатов уменьшает прогрессирование раковых опухолей, однако только в 1983 установили, что иммуностимулирующие свойства лизата обусловленные молекулами ДНК бактерии. В 1995 году показали, что стимуляция иммунитета вызвана CpG-мотивами бактериальной ДНК. У бактерий, а также ДНК-вирусов, эти мотивы являются неметилованимы. В организме человека и высших приматов, наоборот, цитозин в составе большинства CpG-динуклеотидов содержит метильную группу. Поэтому неметиловани CpG-мотивы воспринимаются человеческим организмом как патагенасоцийовани молекулярные паттерны (PAMP, pathogen-associated molecular patterns). Рамри-соединения распознаются Toll-подобными рецепторами, которые в зависимости от типа лиганда, разделяют на несколько типов. Неметиловани CpG-мотивы распознает рецептор TLR-9, расположенный на мембранах эндоплазматического ретикулума В-лимфоцитов, дендритных клеток и натуральных киллеров. Связывание рецептора с неметилованимы CpG-мотивами запускает каскад реакций, в результате которого индуцируется синтез провоспалительных цитокинов — интерферона-1 и IL-12.

Экспрессия цитокинов и других иммуномодуляторов

Для ДНК-вакцинации в качестве адъювантов чаще всего применяют гены цитокинов. Цитокины — это класс белковых молекул, регулирующих межклеточные и межсистемные взаимодействия в организме, в частности, функционирование иммунной системы. Все цитокины, а их известно более 30 могут модулировать иммунный ответ. Цитокины IL2, IL-12, интерферон γ, IL-15, IL-18 и IL-23 оказывают стимулирующее влияние на Т-хелперы первого класса. К цитокинов, модулируют действие Т-хелперов второго класса, относятся: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Тип цитокина подбирают согласно того, какой тип иммунного ответа хотят усилить.

Добиться повышения иммунного ответа можно с помощью хемокинов. Хемокины — это семейство цитокинов, которые способны вызвать хемотаксис чувствительных к ним клеток, в том числе и иммунных. В частности, рецепторы к хемокинов является на антигенперезентуючих клетках хемокинов. Связывание Хемокиновые со своим рецептором приводит к эндоцитоза комплекса антиген-хемокин внутрь АПК. Эта стратегия эффективно используется как при разработке противовирусных ДНК-вакцин, так и противоопухолевых.

Функцию адъюванта также может выполнять белок HSP70 (heat-shock proteins, белки теплового шока). Иммуностимулирующее действие HSP70 основано на его способности выходить во внеклеточное пространство и связываться с рецепторами АПК. Механизм транспорта HSP70 наружу пока окончательно не выяснен, но скорее всего существует несколько путей — экзоцитоз, секреция наружу или выход через канал. Связывание HSP70 со своим рецептором приводит к активации дендритных клеток, опосредует презентацию антигена и стимулирует продукцию хемокинов. Поскольку антиген слит с HSP70, он также попадает во внеклеточное пространство, поэтому может презентоваться по пути МЧС-II и активировать В-клетки. Во избежание аутоиммунных реакций для ДНК-вакцин используют бактериальный ген HSP70.

Преимущества и недостатки ДНК-вакцин

Метод ДНК-вакцинации обладает рядом преимуществ, наиболее важной из которых является запуск как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Вакцины на основе ДНК обеспечивают долговременную экспрессию антигена и, соответственно, устойчивую иммунный ответ. К дополнительным факторам, способствующим развитию ДНК-иммунизации, относят простоту и низкую стоимость производства вакцины.

Применение ДНК-вакцин

Первые клинические исследования ДНК-вакцин, вместе безопасностью нового метода, продемонстрировали его низкую эффективность. Понимая перспективность ДНК-иммунизации, научные лаборатории вместе с биотехнологическими компаниями направили свои усилия на оптимизацию нового метода, и уже через несколько лет удалось добиться значительного прогресса. В 2005 году первая ДНК-вакцина получила разрешение FDA (англ. Food and Drug Administration) для применения на животных. По состоянию на 2013 г.. Больше ста ДНК-вакцин проходят клинические испытания и четыре ДНК-вакцины лицензированы для использования в животноводстве.

ДНК-вакцины в ветеринарии

Все четыре одобрены FDA вакцины созданы на основе плазмид. Для трех из них рекомендован производителем способ введения — внутримышечно, для вакцины LifeTide® — инъекция, соединенная с электропорации. Если остальные вакцин направлена ​​на активацию иммунитета, то для вакцины LifeTide® иммуностимулирующее действие является дополнительной. Продукт вакцины — Соматолиберин, гормон стимулирующий высвобождение гипофизом гормона роста и пролактина. Действие последних двух гормонов у свиней приводит к росту массы животных и увеличение количества выводке. Вместе с тем, введение животным плазмиды, кодирующей Соматолиберин, стимулирует выработку Т-лимфоцитов, натуральных киллеров, следовательно увеличивает иммунный сопротивление организма.

Перспективы ДНК-вакцинации

Противоопухолевые ДНК-вакцины

В то время как индукция клеточного и гуморального иммунного ответа убедительно продемонстрирована для чужеродных антигенов, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, применение ДНК-вакцин для лечения рака до сих пор было менее успешным. Индукция эффективного противоопухолевого иммунитета является сложной задачей. Клинические исследования подтвердили общую безопасность и низкую токсичность противоопухолевых ДНК-вакцин, однако эффективность вызванной ими иммунного ответа оказалась слабой, а противоопухолевая активность, в некоторых случаях, вообще сомнительна.

ДНК-вакцины против вирусных и бактериальных возбудителей

ДНК-вакцина против кариеса

Причиной кариеса является локальное изменение pH в результате брожения (гликолиза) углеводов, осуществляемого бактериями. Учеными из Уханська Института вирусологии (Китай) была разработана ДНК-вакцина направлена ​​против одного из возбудителей кариеса — Streptococcus mutans. Вакцина построена на основе плазмиды и кодирует два белка: поверхностный протеин St. mutans PAc и флагелин, полученный из бактерии Salmonella, который выполняет роль адъюванта. На стадии доклинических исследований вакцину через нос вводили лабораторным грызунам, после чего у животных проверяли уровень иммуноглобулинов G в сыворотке крови и секреторных иммуноглобулинов А в слюне. После проведенных исследований ученые выяснили, что уровень иммунных белков и в крови, и в слюне повышался, но, что важнее, при этом тормозился рост колоний Streptococcus mutans на зубной эмали. То есть, зубы вакцинированных животных были лучше защищены от кариеса.

ДНК-вакцины и лечения аутоиммунных заболеваний

ДНК-вакцина против диабета 1 типа

Сахарный диабет типа 1 характеризуется потерей инсулин-продуцирующих бета-клеток, расположенных в островках Лангерганса поджелудочной железы. Главная причина потери бета-клеток — аутоиммунное поражение Т-киллерами. Для того, чтобы защитить бета-клетки от гиперактивного функции иммунной системы, ученые из Стэнфордского (США) и Лейденского (Нидерланды) университетов, разработали ДНК-вакцину BHT-3021. Вакцина создана на основе плазмиды и кодирует предшественник инсулина — проинсулин. Это вакцина обратной силы: если обычные вакцины должны активировать иммунные реакции, то BHT-3021, наоборот, нейтрализует цитотоксическое действие Т-киллеров направленную против островков Лангерганса.

В первой фазе клинических испытаний BHT-3021 показала свою эффективность на группе 80 человек. Половина из них каждые семь дней в течение 12 недель получала внутримышечные инъекции BHT-3021, а вторая половина — плацебо. По истечении этого срока группа, которая получала вакцину, продемонстрировала повышение уровня С-пептидов в крови, что свидетельствует о восстановлении функции бета-клеток. Никаких серьезных побочных эффектов у одного из участников зафиксировано не было. Действие вакцины сохранялась в течение 2 месяцев.

Процесс введения рекомбинантной ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией . Результатом трансформации является приобретение клеткой-хозяином новых последовательностей ДНК и, следовательно, новых фенотипических признаков, например - устойчивости к определенным антибиотикам. Клетка-хозяин, используемая в таких экспериментах, должна иметь определенный фенотип, в частности r - , т.е. в ней не должно быть ферментов рестрикции; онадолжна быть неспособна к общей рекомбинации (recA -) , чтобы экзогенная ДНК не модифицировалась в результате гомологичной рекомбинации. Одна из самых широко используемых для этих целей культур – это лабораторный штамм бактерий E.coli – штамм К12.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Компетентность E. coli необходимо индуцировать, а некоторые другие бактерии обладают этим свойством изначально. Долю компетентных клеток можно повысить, используя специальную питательную среду или условия культивирования. Для бактерий, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Самыми часто применяемыми в лабораторной практике приемами трансформации бактериальных клеток являются:

Трансформация E.coli с помощью обработки хлоридом кальция;

электропорация – увеличение проницаемости клеток под воздействием импульса тока длительностью ~4,5 мс;

Результаты трансформации можно оценивать количественно: определяя либо частоту , либо эффективность трансформации.

Частота трансформации – доля клеток в клеточной популяции, получивших чужеродную ДНК; выражается числом трансформантов к общему числу клеток.

Эффективность трансформации - число трансформантов в расчете на 1 мкг ДНК, взятой для трансформации.

Информация по клонированию рекомбинантных ДНК с помощью плазмидного вектора pBR322, изложенная в данном разделе, суммирована в виде схемы эксперимента и представлена на рисунке 20.

Рис. 20. Клонирование ДНК в плазмидном векторе pBR322

1, 2, 3, 4 и 5 – этапы процедуры клонирования (см. текст).

1. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в участке, определяющем устойчивость к ампициллину.

2. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет обеспечить им выживание на среде с ампициллином.

3. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК.

4. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформации высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, т.е. отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, т.е. восстановилась первоначальная структура вектора.

5. Индивидуальные колонии клеток E.coli , выросшие на чашке с тетрациклином пересевают на чашки две чашки, одна из которых содержит агар с ампициллином, а вторая – с тетрациклином. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК. В то время как клетки с исходной, т.е. восстановленной векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, т.е. в исходном состоянии.

Из клеток отобранных клонов E.coli экстрагируют плазмидную ДНК и анализируют ее структуру.

Другие плазмидные векторы

Эпоха вектора pBR322, начатая Боливаром и Родригесом в самом начале 80-тых годов ХХ-го столетия, продолжается и по сей день. Однако, при всей своей надежности и классическом соответствии всем необходимым для векторов требованиям, этот вектор имеет всего несколько удобных сайтов для клонирования. Кроме того, отбор трансформированных клеток в экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени. Возникла необходимость разработки альтернативных, более совершенных, систем клонирования. Так была создана группа векторов семейства pUC. В названии векторов этого семейства буквы ”U” и “C” – это первые буквы от слов University of California . Исследователями этого университета была создана серия векторов, имебющих важную черту– наличие в структуре ДНК встроенного синтетического полилинкера , который представляет собой последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора - MCS (Multiple Cloning Sites). Названия индивидуальных векторов из семейства pUC отличаются двузначным числом, а первичная структура разных векторов отличается составом сайтов MCS MCS – Multiple Cloning Sites в полилинкере.

Рассмотрим подробнее особенности векторов, входящих в эту группу, на примере вектора pUC19 (рис. 21).

Плазмида pUC19 имеет длину 2686 п. н. и содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ") лактозного оперона E.coli, ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ"; полилинкер - короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХmаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HinсII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плазмиды ColE1.

Рис. 21. Плазмидный вектор pUC19

Объяснение к карте дано в тексте.

Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком. Такие модульные элементы структуры рассматриваемого вектора как lacZ" , lacI и MCSдают возможность ускорить и интенсифицировать процедуру селекции клонов с рекомбинантными ДНК.

Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac- оперона, то продукт гена lacI, так называемый репрессор , не сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ", и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lacZ". Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация ), и в результате образуется активная ß-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ" так, что она не влияет на продукцию функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную, т.е. без вставки чужеродной ДНК, плазмиду pUC19 (рис. 22).

Рис. 22. Последовательность процедур клонирования ДНК в векторе pUC19.

1, 2, 3 и 4 – этапы клонирования (см. текст)

1. Донорную ДНК обрабатывают одной из эндонуклеаз рестрикции, для которой имеется сайт в полилинкере. Векторную ДНК pUC19 обрабатывают тем же ферментом

2. Лигирование линеаризованного вектора и вставки с помощью ДНК-лигазы Т4.

3. После процедуры лигирования инкубационной смесью проводят трансформацию клеток, способных к α-комплементации, которые могут синтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ" с образованием активного фермента.

4. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для ß-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную, т.е. рекомбинантную, плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии. Это связано с тем, что обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК не может образовываться полноценный продукт гена lacZ" , и, следовательно, в процессе α-комплементации не образуется активная ß-галактозидаза, расщепляющая субстрат X-Gal до продукта, который и обеспечивает окрашивание клеток колоний в синий цвет.

Векторы на основе бактериофага λ

Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, размеры которых не превышают 10 т.п.н. Однако для решения задачи клонирования хромосомной ДНК даже небольшого организма, например – бактерии, необходимо создавать полные коллекции фрагментов этой ДНК, поэтому часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Ε. coli.

При проникновении фага λ в клетки E.coli. существуют два альтернативных пути развития событий:

1. Литический цикл – фаг начинает активно размножаться и примерно через 20 минут клетка разрушается с высвобождением до 100 новых фаговых частиц.

2. Состояние лизогении – фаговая ДНК включается в хромосому E.coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными клетками. Однако при неблагоприятных условиях (нехватка питания) запускается литический цикл (рис. 23):

1. При репликации кольцевой ДНК бактериофага λ образуется линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т.п.н. Каждый из этих сегментов представляет собой полноразмерную фаговую ДНК, фланкированную липкими cos -сайтами - одноцепочечными 5"-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos ) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом подобно липким концам рестрикционных фрагментов.

2. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток.

Рис. 23. Литический путь развития бактериофага λ

1 – упаковка в головку фага одного сегмента полноразмерной фаговой ДНК; 2 – сборка полноценной фаговой частицы.

Размер ДНК фага λ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного" фага, “вставшего" на литический путь развития. Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы (рис. 24).

Рис. 24. Использование векторов на основе фага λ для клонирование фрагментов ДГК в клетках Ε. сoli .

Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro ДНК фага λ проводят с помощью двух штаммов E.coli , каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ (рис. 25). Один из мутантов не способен синтезировать белок А (один из полипептидов фаговой терминазы), другой – белок Е (белок головки фага). Оба этих белка необходимы для упаковки ДНК фага λ. “А”- и “Е”-экстракты смешивают и добавляют конкатемерную (сегменты полноразмерной фаговой ДНК, полимеризованные по cos -сайтам) ДНК фага, которая связывается с терминазой прежде, чем происходит разрезание в cos -сайтах, и упаковывается в фаговые головки.

Рис. 25. Упаковка in vitro ДНК фага λ

При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т.п.н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.

Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реципиенты основан на естественном природном явлении – трансдукции фаговой ДНК.

Трансдукция (лат. transduction - перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клеток-реципиентов или какого-либо специального приборного оснащения.

Для поиска клеток, содержащих фаги с рекомбинантными ДНК, используют методы молекулярной гибридизации и иммунологический скрининг, которые рассмотрим в следующем разделе.