Komplexná diagnostika metódou RIF. Laboratórna diagnostika syfilisu Punkcia regionálnych lymfatických uzlín

V súčasnosti sú široko používané sérologické reakcie zahŕňajúce značené antigény alebo antigény. Patria sem imunofluorescenčné reakcie, rádioimunitné a enzýmové imunoanalytické metódy.

Uplatňujú sa:

1) na sérodiagnostiku infekčných chorôb, t.j. na detekciu AT pomocou súboru známych konjugovaných (chemicky kombinovaných) antigénov s rôznymi značkami (enzýmy, fluorochrómové farbivá);

2) na stanovenie mikroorganizmu alebo jeho sérovaru pomocou štandardne značených diagnostických protilátok (rýchla diagnostika).

Séra sa pripravujú imunizáciou zvierat vhodnými antigénmi, potom sa izolujú imunoglobulíny a konjugujú sa so svetelnými farbivami (fluorochrómami), enzýmami a rádioizotopmi.

Označené SR nie sú v špecificite horšie ako iné SR a vo svojej citlivosti sú lepšie ako všetky SR.

Žiadne podobné materiály

Ako etikety sa používajú svetelné fluorochrómové farbivá (fluoresceín izotiokyanát atď.).

Existujú rôzne modifikácie RIF. Na expresnú diagnostiku infekčných chorôb sa Koons RIF používa na identifikáciu mikróbov alebo ich antigénov v testovanom materiáli.

Existujú dve metódy RIF podľa Koonsa: priame a nepriame.

Priame komponenty RIF:

1) vyšetrovaný materiál (stolica vylučovaná nosohltanom atď.);

2) označené špecifické imunitné sérum obsahujúce AT-la na požadovaný antigén;

3) izotonický roztok chloridu sodného.

Rozter z testovaného materiálu sa ošetrí značeným antisérom.

Dochádza k AG-AT reakcii. Počas luminiscenčného mikroskopického vyšetrenia sa fluorescencia deteguje v oblasti, kde sú lokalizované komplexy AG-AT.

Komponenty nepriameho RIF:

1) materiál, ktorý sa študuje;

2) špecifické antisérum;

3) antiglobulínové sérum (AT-la proti imunoglobulínu), označené fluorichrómom;

4) Izotonický roztok chloridu sodného.

Náter z testovaného materiálu sa najskôr ošetrí imunitným sérom na požadovaný antigén a potom značeným antiglobulínovým sérom.

Luminiscenčné komplexy AG-AT - značené AT sa detegujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Výhodou nepriamej metódy je, že nie je potrebné pripravovať široké spektrum fluorescenčných špecifických sér, ale používa sa iba jedno fluorescenčné antiglobulínové sérum.

Existuje aj 4-zložkový typ nepriameho RIF, keď sa dodatočne zavádza komplement (sérum z morčiat). Pri pozitívnej reakcii vzniká komplex AG-AT - značený - AT-komplement.

RIF je založený na kombinácii antigénov baktérií, rickettsie a vírusov so špecifickými protilátkami značenými fluorescenčnými farbivami (fluoresceín izotiokyanát, rodamín, B-izotikyanit, lisatín rodamín B-200, sulfochlorid atď.), ktoré majú reaktívne skupiny (sulfochloridit, izotiocyanit , atď.) . Tieto skupiny sa kombinujú s voľnými aminoskupinami molekúl protilátky, ktoré pri pôsobení fluorochrómu nestrácajú svoju špecifickú afinitu k zodpovedajúcemu antigénu. Výsledné AG-AT komplexy sa pod fluorescenčným mikroskopom stávajú jasne viditeľnými, jasne svietiacimi štruktúrami (obr. 7). RIF dokáže detekovať malé množstvá bakteriálnych a vírusových antigénov. Metóda RIF sa používa v dvoch verziách: priama a nepriama metóda.

Priama metóda je založená na priamej kombinácii antigénu so značenou protilátkou. Nepriama metóda je založená na postupnej detekcii komplexu AG-AT pomocou fluorescenčných farbív. Prvým stupňom je tvorba imunitných komplexov špecifického antigénu so špecifickými protilátkami. Druhou fázou je identifikácia tohto komplexu jeho ošetrením značeným antigamaglobulínom.

Výhodou RIF je jednoduchosť, vysoká citlivosť a rýchlosť získavania výsledkov. RIF sa používa ako metóda na včasnú expresnú diagnostiku chrípky, dyzentérie, malárie, moru, tularémie, syfilisu atď. Na uskutočnenie takejto štúdie sa používa fluorescenčný mikroskop.

Rádioimunoanalýza (RIA)

RIA je jednou z najcitlivejších imunodiagnostických metód. Používa sa na detekciu antigénu vírusu hepatitídy B u pacientov s vírusovou hepatitídou. Na tento účel sa do testovacieho séra pridá referenčné sérum (sérum obsahujúce protilátky proti vírusu hepatitídy B). Zmes sa inkubuje 1-2 dni pri teplote 40 °C, potom sa pridá referenčný antigén (antigén značený izotopom 125J) a inkubácia pokračuje ďalších 24 hodín. Do výsledného komplexu antigén-protilátka sa pridávajú precipitujúce antiimunoglobulíny proti referenčným sérovým proteínom, čo vedie k tvorbe precipitátu (obr. 8). Výsledok sa berie do úvahy prítomnosťou a počtom impulzov v zrazenine zaznamenaných počítadlom. Ak sa v testovacom sére nachádza antigén, ktorý sa naviaže na špecifické protilátky, tieto neinteragujú so značeným antigénom, a preto sa v precipitáte nezistí. RIA je teda založená na princípe kompetitívnej interakcie stanovovaného antigénu a ako značky sa používa známe množstvo značeného antigénu s aktívnymi centrami protilátok.

V závislosti od techniky stagingu existujú dve metódy RIA.

1) Technika „kvapalnej fázy“ (klasická RIA). Nevýhodou tejto inscenačnej techniky je potreba

špeciálna separácia voľných a viazaných značených antigénov (alebo protilátok).

2) Technika „tuhej fázy“.

AG alebo AT známej špecifickosti sa viažu na sorbenty (tuhá fáza) - steny polystyrénovej jamky alebo plastovej trubice. Zvyšné zložky IC sa postupne sorbujú na imobilizovaný AG (AT).

V závislosti od povahy reakcie sa rozlišujú tieto metódy:

1) Konkurenčná metóda – metóda založená na AG konkurencii.

Zložky reakcie:

a) stanovená hypertenzia (testovaný materiál - krv, spútum atď.);

b) antigén identický s testovaným Ag, označený rádioizotopom;

c) špecifické AT známej koncentrácie viazané na sorbent;

d) štandardná hypertenzia (kontrola);

e) tlmivý roztok.

Najprv sa do reakcie zavedie testovací AG. Na povrchu sorbentu dochádza k tvorbe komplexu AG-AT. Sorbent sa premyje a potom sa zavedie značený AG. Čím vyšší je obsah skúmaného AG, tým menej značeného AG sa viaže na AT-m na povrchu sorbentu. Koncentrácia značeného AG sa stanoví meraním rádioaktivity reakcie pomocou čítačov. Množstvo rádioaktivity v reakcii bude nepriamo úmerné množstvu AG v testovanej vzorke.

2) Nekonkurenčná metóda.

Zložky reakcie:

a) zistiteľná hypertenzia;

b) špecifické AT-a známej koncentrácie, spojené

na sorbente;

c) protilátky identické s naviazanou protilátkou, označené

rádioizotop;

d) štandardná AG;

e) tlmivý roztok.

Testovaný AG sa pridá k naviazaným protilátkam. Počas procesu inkubácie sa na sorbente vytvárajú komplexy AG-AT. Sorbent sa vymyje z voľných zložiek a pridajú sa označené AT, ktoré sa viažu na voľné valencie AG v komplexe. Množstvo rádioaktivity je úmerné koncentrácii skúmaného antigénu.

3) „Sendvičová metóda“ (nepriama metóda) - najbežnejšia metóda.

Komponenty:

a) testovacie sérum (alebo testovací antigén);

b) AG-s viazané na sorbent (alebo AT-la viazané na sorbente pri stanovení AG-a);

c) diagnostické protilátky proti imunoglobulínom, značené rádioizotopmi;

d) kontrolné séra (alebo AG);

e) tlmivé roztoky.

Testované AT (alebo AG) reagujú s AG na pevnej fáze (AT), potom sa inkubát odstráni a do reakcie sa zavedú značené antiglobulínové Ab, ktoré sa viažu na špecifické komplexy AG-AT na povrchu sorbentu. Množstvo rádioaktivity reakcie je priamo úmerné množstvu testovanej protilátky (alebo AG).

Výhody RIA:

1) vysoká špecifickosť a citlivosť;

2) jednoduchosť inscenačnej techniky;

3) presnosť kvantitatívneho hodnotenia výsledkov;

4) ľahko sa automatizuje.

Nevýhoda: použitie rádioaktívnych izotopov.

Žiadne podobné materiály (

Enzymovo viazaná imunosorbentná metóda (ELISA)

Metóda sa používa na detekciu antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných na značkový enzým (chrenová peroxidáza, b-galaktóza alebo alkalická fosfatáza). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát a chromogén. Substrát je štiepený enzýmom a jeho produkty degradácie spôsobujú chemickú modifikáciu chromogénu. Chromogén zároveň mení svoju farbu – intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky (obr. 9).

Najbežnejšia je ELISA na pevnej fáze, pri ktorej sa jedna zo zložiek imunitnej reakcie (antigén alebo protilátka) adsorbuje na pevný nosič. Ako pevný nosič sa používajú polystyrénové mikropanely. Pri stanovovaní protilátok sa do jamiek so sorbovaným antigénom postupne pridáva krvné sérum pacienta, enzýmom značené antiglobulínové sérum a zmes roztokov enzýmu a chromogénového substrátu. Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá z jamiek odstránia dôkladným premytím. Ak je výsledok pozitívny, zmení sa farba roztoku chromogénu. Nosič v tuhej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkou. Potom sa do jamiek so sorbovanými protilátkami pridá požadovaný antigén, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá zmes substrátových roztokov pre enzým a chromogén.

ELISA sa používa na diagnostiku ochorení spôsobených vírusovými a bakteriálnymi patogénmi Ako značky sa používajú enzýmy: peroxidáza, alkalická fosfatáza atď.

Indikátorom reakcie je schopnosť enzýmov vyvolať farebné reakcie pri pôsobení na príslušný substrát. Napríklad substrátom pre peroxidázu je roztok ortofenyldiamínu.

Najpoužívanejšia je ELISA na pevnej fáze. Podstata ELISA je podobná ako RIA.

Výsledky ELISA sa môžu hodnotiť vizuálne a meraním optickej hustoty na spektrofotometri.

Výhody ELISA zahŕňajú:

Žiadny kontakt s rádioaktívnymi látkami;

Jednoduchosť metód hodnotenia reakcií;

Stabilita konjugátov;

Ľahko prístupné automatizácii.

V porovnaní s RIA je však zaznamenaná nižšia citlivosť metódy, ale v niektorých prípadoch je citlivosť lepšia ako RIF a RIM.

Nasledujúce typy ELISA sú uvedené ako príklady:

Konkurenčný typ.

Účel.

Navrhnuté na detekciu povrchového antigénu vírusu hepatitídy B (HB3Ad) v sére a krvnej plazme pri diagnostike vírusovej hepatitídy B a na stanovenie prenosu HB5Ad.

Komponenty:

1) testovaným materiálom je sérum alebo krvná plazma;

2) protilátky proti HB3 Ad, adsorbované na povrchu jamky polystyrénovej mikrodoštičky;

3) konjugát - myšacie monoklonálne protilátky proti HB3 Ad, značené peroxidázou,

4) ortofenyléndiamín (OPD) - substrát;

5) fyziologický roztok pufrovaný fosfátom;

6) kontrolné séra:

Pozitívne (sérum s HBeAd);

Negatívne (sérum bez HB3 Ad). Pokrok

1) Pridanie kontrolných a testovacích sér.

2) Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

3) Umytie dier.

4) Pridanie konjugátu.

5) Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

6) Umývanie otvorov.

7) Vstup do OFD. V prítomnosti HB3 roztok v jamkách zožltne.

Účtovanie ELISA sa vykonáva pomocou optickej hustoty pomocou fotometra. Stupeň optickej hustoty bude nepriamo úmerný koncentrácii študovaných NVs Ad.

Mechanizmus

Reakcia prebieha v troch fázach:

1) HB3 Ad z testovaného séra (plazmy) sa viaže na homológne Absorpcie na povrchu jamky. Vytvorí sa IR AG-AT. (NVz Ad - agl\NVz AT).

2) Protilátky HB3Ad značené peroxidázou sa viažu na zostávajúce voľné determinanty komplexu HB3Ad AG-AT. Vznikne komplex AT-AG-značený AT (ap!1 HB3 AT-HB3 Ad-ap(1 HB3 AT, značený peroxidázou).

3) OPD interaguje (s peroxidázou) komplexu AT-AG-AT a dochádza k žltému sfarbeniu.

Nepriamy typ

Je to hlavná testovacia reakcia na diagnostiku infekcie HIV.

Účel: sérologická diagnostika HIV infekcie - detekcia protilátok proti HIV antigénom, Komponenty:

1) testovací materiál - krvné sérum;

2) syntetické

Punkcia regionálnych lymfatických uzlín

Sérologická diagnostika

• Wassermanova reakcia (WR),
• sedimentárne reakcie Kahna a Sachs-Vitebského (cytocholické),
• reakcia na skle (expresná metóda),

• imobilizačná reakcia treponema pallidum (reakcia treponema pallidum),
• imunofluorescenčná reakcia (RIF).

Wassermanova reakcia (WR)

RV je zvyčajne diagnostikovaná s dvoma alebo tromi antigénmi. Najčastejšie sa používa vysoko citlivý kardiolipínový antigén (extrakt z hovädzieho srdca obohatený o cholesterol a lecitín) a treponémový antigén (sonifikovaná suspenzia anatogénneho kultivovaného treponemes pallidum). Spolu s reaginami v sére pacienta tvoria tieto antigény imunitný komplex schopný adsorbovať a viazať komplement. Na vizuálne stanovenie vytvoreného komplexu (reaginuje + antigén + komplement) sa ako indikátor používa hemolytický systém (zmes ovčích erytrocytov s hemolytickým sérom). Ak je komplement naviazaný v 1. fáze reakcie (reaginuje + antigén + komplement), nedochádza k hemolýze – červené krvinky sa vyzrážajú na ľahko znateľný precipitát (PB pozitívny). Ak vo fáze 1 nie je komplement naviazaný v dôsledku absencie reaginov v testovacom sére, bude použitý hemolytickým systémom a dôjde k hemolýze (RT negatívna). Stupeň závažnosti hemolýzy pri stagingu RV sa hodnotí plusmi: úplná absencia hemolýzy ++++ alebo 4+ (RV je ostro pozitívna); sotva začatá hemolýza +++ alebo 3+ (RV pozitívna); významná hemolýza ++ alebo 2+ (RV slabo pozitívna); nejasný obraz hemolýzy ± (RV je pochybná); úplná hemolýza - (Wassermannova reakcia negatívna).

Okrem kvalitatívneho hodnotenia PB existuje kvantitatívne hodnotenie s rôznymi riedeniami séra (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reaginový titer je určený maximálnym riedením, ktoré stále poskytuje výrazne pozitívny (4+) výsledok. Kvantitatívny staging RV je dôležitý pri diagnostike niektorých klinických foriem syfilitickej infekcie, ako aj pri monitorovaní účinnosti liečby. V súčasnosti sa Wassermanova reakcia uskutočňuje s dvoma antigénmi (kardiolipín a treponemálny kmeň Reiter). Spravidla sa RV stáva pozitívnou 5-6 týždňov po infekcii u 25-60% pacientov, po 7-8 týždňoch - u 75-96%, po 9-19 týždňoch - pri 100%, hoci v posledných rokoch niekedy skôr alebo neskôr . Súčasne sa titer reaginu postupne zvyšuje a dosahuje maximálnu hodnotu (1:160-1:320 a viac) v prípade generalizovaných vyrážok (sekundárny čerstvý syfilis). Keď je RV pozitívna, stanoví sa diagnóza primárneho séropozitívneho syfilisu.
So sekundárnym čerstvým a sekundárny recidivujúci syfilis je RV pozitívna u 100 % pacientov, ale u vyčerpaných pacientov s oslabenou imunitou možno pozorovať negatívny výsledok. Následne titer reaginu postupne klesá a v prípade sekundárneho recidivujúceho syfilisu zvyčajne nepresiahne 1:80-1:120.
Pre terciárny syfilis RV je pozitívna u 65-70% pacientov a zvyčajne sa pozoruje nízky titer reaginácie (1:20-1:40). Pri neskorých formách syfilisu (syfilis vnútorných orgánov, nervový systém) sa pozoruje pozitívna RV v 50-80% prípadov. Reaginový titer sa pohybuje od 1:5 do 1:320.
Na latentný syfilis pozitívna RV sa pozoruje u 100 % pacientov. Reaginový titer je od 1:80 do 1:640 a pri neskorom latentnom syfilise od 1:10 do 1:20. Rýchly pokles titra reaginu (až do úplnej negativity) počas liečby naznačuje účinnosť liečby.

Nevýhody Wassermanovej reakcie- nedostatočná citlivosť (negatívna v počiatočnom štádiu primárneho syfilisu). Negatívny je aj u 1/3 pacientov, ak boli v minulosti liečení antibiotikami, u pacientov s terciárne aktívnym syfilisom s léziami kože a slizníc, osteoartikulárneho aparátu, vnútorných orgánov, centrálneho nervového systému a s neskorým vrodeným syfilis.
Nedostatok špecifickosti- Wassermanova reakcia môže byť pozitívna u ľudí, ktorí predtým nemali a nemajú syfilis. Falošne pozitívne (nešpecifické) výsledky RV sa pozorujú najmä u pacientov, ktorí trpia systémovým lupus erythematosus, leprou, maláriou, malígnymi novotvarmi, poškodením pečene, rozsiahlym infarktom myokardu a inými ochoreniami a niekedy aj u úplne zdravých ľudí.
Zistí sa krátkodobá falošne pozitívna Wassermanova reakcia u niektorých žien pred alebo po pôrode, u drogovo závislých, po narkóze alebo pití alkoholu. Falošne pozitívna RV je spravidla slabo vyjadrená, často s nízkym titrom reaginácie (1:5-1:20), pozitívna (3+) alebo slabo pozitívna (2+). Pri hromadných sérologických prieskumoch je frekvencia falošne pozitívnych výsledkov 0,1 – 0,15 %. Na prekonanie nedostatočnej citlivosti používajú chladový test (Kolyarova reakcia) a zároveň sa vykonáva s inými sérologickými reakciami.

Sedimentárne reakcie Kahna a Sachsa-Vitebského

Treponema pallidum imobilizačná reakcia (TPI)

Imunofluorescenčná reakcia (RIF)

Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA)

Technika odberu krvi pre sérologické testy

Sérologická rezistencia

• Pravda(absolútne, bezpodmienečné) - je potrebné vykonať dodatočnú antisyfilitickú liečbu kombinovanú s nešpecifickou terapiou na zvýšenie imunitných síl tela.
• Relatívna- po úplnom preliečení sa z treponema pallidum tvoria cysty alebo L-formy, ktoré sú v organizme v málo virulentnom stave a v dôsledku toho dodatočná liečba nemení ukazovatele sérologických reakcií, najmä RIF a RIBT.

Pseudoodolnosť- po liečbe, napriek pozitívnym sérologickým reakciám, Treponema pallidum v tele chýba. V tele nie je žiadny antigén, ale pokračuje tvorba protilátok, ktoré sa zisťujú pri sérologických reakciách.
Sérologická rezistencia sa môže vyvinúť v dôsledku:

• nedostatočná liečba bez zohľadnenia trvania a štádia ochorenia;
• nedostatočná dávka a najmä v dôsledku nezohľadnenia telesnej hmotnosti pacientov;
• porušenie intervalu medzi podávaním lieku;
• pretrvávanie treponema pallidum v organizme napriek úplnej špecifickej liečbe v dôsledku ich rezistencie na penicilín a iné chemoterapeutické lieky v prítomnosti skrytých, encystovaných lézií vo vnútorných orgánoch, nervovom systéme, lymfatických uzlinách, ktoré sú nedostupné pre antibakteriálne lieky (treponema pallidum sa často nachádzajú v tkanivách jaziev mnoho rokov po ukončení terapie, v lymfatických uzlinách je niekedy možné zistiť treponema pallidum 3-5 rokov po antisyfilitickej liečbe);
• zníženie ochranných síl pri rôznych chorobách a intoxikáciách (endokrinopatie, alkoholizmus, drogová závislosť atď.);
• celková vyčerpanosť (jedenie potravy chudobnej na vitamíny, bielkoviny, tuky).

• sprievodné nešpecifické ochorenia vnútorných orgánov, poruchy kardiovaskulárneho systému, reumatizmus, dysfunkcia endokrinného a nervového systému, ťažké chronické dermatózy, zhubné novotvary;
• poškodenie nervového systému (ťažké zranenia, otras mozgu, duševná trauma);
• tehotenstvo; chronická intoxikácia alkoholom, nikotínom, drogami; infekčné choroby (malária, tuberkulóza, vírusová hepatitída, úplavica, týfus, týfus a recidivujúca horúčka).

V súčasnosti sa vo veľkej miere využívajú sérologické reakcie (SR), na ktorých sa podieľajú značené antigény alebo protilátky. Tieto zahŕňajú imunofluorescenčnú reakciu, rádioimunitné a enzýmové imunoanalytické metódy, imunoblotovaciu reakciu, prietokovú cytometriu a elektrónovú mikroskopiu.

Uplatňujú sa:

1) na sérodiagnostiku infekčných chorôb, t.j. na detekciu protilátok pomocou súboru známych konjugovaných (chemicky kombinovaných) antigénov s rôznymi značkami (enzýmy, fluorochrómové farbivá);

2) na stanovenie mikroorganizmu alebo jeho sérovaru pomocou štandardne značených diagnostických protilátok (rýchla diagnostika).

Diagnostické séra sa pripravujú imunizáciou zvierat vhodným antigénom, potom sa izolujú imunoglobulíny a konjugujú sa so svetelnými farbivami (fluorochrómami), enzýmami a rádioizotopmi.

Diagnostické monoklonálne protilátky sa vyrábajú pomocou hybridných buniek vytvorených fúziou imunitného B lymfocytu s myelómovou bunkou. Hybridómy sú schopné rýchlo sa množiť in vitro v bunkovej kultúre a produkovať imunoglobulín charakteristický pre odobratý B-lymfocyt.

Označené SR nie sú v špecificite horšie ako iné SR a vo svojej citlivosti sú lepšie ako všetky SR.

Imunofluorescenčná reakcia (RIF)

Ako etikety sa používajú svetelné fluorochrómové farbivá (fluoresceín izotiokyanát atď.).

Existujú rôzne modifikácie RIF. Na expresnú diagnostiku infekčných chorôb sa Koons RIF používa na identifikáciu mikróbov alebo ich antigénov v študovanom materiáli.

Existujú dve metódy RIF podľa Koonsa: priame a nepriame.

Priame komponenty RIF:

1) testovací materiál (stolica, výtok z nosohltanu atď.);

2) označené špecifické imunitné sérum obsahujúce protilátky proti požadovanému antigénu;

3) izotonický roztok chloridu sodného.

Rozter z testovaného materiálu sa ošetrí značeným antisérom.

Dochádza k AG-AT reakcii. Počas luminiscenčného mikroskopického vyšetrenia sa fluorescencia značky deteguje v oblasti, kde sú lokalizované komplexy AG-AT (obr. 34).

Komponenty nepriamy RIF určený na rýchlu diagnostiku chrípky typu A:

1) testovaný materiál sa vymyje z nosohltanu pacienta s podozrením na chrípku;

2) špecifické antisérum s protilátkami proti vírusu chrípky A;

3) antiglobulínové sérum (AT proti imunoglobulínu), označené fluorochrómom;

4) izotonický roztok chloridu sodného.

Náter z testovaného materiálu sa najskôr ošetrí imunitným sérom na požadovaný antigén a potom značeným antiglobulínovým sérom.

Imunitné komplexy AG-AT - značené AT sa detegujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Výhodou nepriamej metódy je, že nie je potrebné pripravovať široké spektrum fluorescenčných špecifických sér, ale používa sa iba jedno fluorescenčné antiglobulínové sérum.

Pre sérologická diagnostika chrípky typu A, teda na stanovenie protilátok proti vírusu chrípky A v krvnom sére pomocou nepriamy RIF použiť influenza diagnosticum (antigén vírusu chrípky A). Sérodiagnostika vírusových infekcií má hlavne retrospektívny charakter a používa sa na potvrdenie diagnózy a epidemiologickú analýzu.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): kompetitívna metóda (stanovenie HBs-AG vírusu hepatitídy B) a nepriama metóda (sérologická diagnostika infekcie HIV)

Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)

Ako značky sa používajú enzýmy: peroxidáza, alkalická fosfatáza atď.

Indikátorom reakcie je schopnosť enzýmov vyvolať farebné reakcie pri pôsobení na príslušný substrát. Napríklad substrátom pre peroxidázu je roztok ortofenyldiamínu (OPD) alebo tetrametylbenzidínu (TMB).

Najpoužívanejšie sú ELISA na pevnej fáze (obr. 35), nepriame a kompetitívne metódy (obr. 36).

Výsledky testu ELISA je možné hodnotiť vizuálne a meraním optickej hustoty na spektrofotometri (analyzátor ELISA).

Výhody ELISA zahŕňajú:

Jednoduchosť metód hodnotenia reakcií;

Stabilita konjugátov;

Ľahko prístupné automatizácii.

Nasledujúce typy ELISA sú uvedené ako príklady:

A) konkurenčný typ

Určené na detekciu povrchového antigénu vírusu hepatitídy B (HBs Ag) v sére a krvnej plazme na diagnostiku vírusovej hepatitídy B a stanovenie nosičstva HBs Ag.

Komponenty:

1) testovací materiál – sérum alebo krvná plazma;

2) protilátky proti HBs Ag, adsorbované na povrchu jamky polystyrénovej mikrodoštičky;

3) konjugát – myšie monoklonálne protilátky proti HBs Ag, značené peroxidázou;

4) ortofenyléndiamín (OPD) – substrát;

5) fosfátovo-fyziologický pufor;

6) kontrolné séra:

Pozitívne (sérum s HBs Ag);

Negatívne (sérum bez HBs Ag).

Pokrok:

2. Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

3. Umývanie otvorov.

4. Pridanie konjugátu.

5. Inkubácia 1 hodinu pri 37 °C.

6. Umývanie otvorov.

7. Zadanie OFD. V prítomnosti HBs Ag roztok v jamkách zožltne.

8. Počítanie ELISA sa vykoná pomocou optickej hustoty pomocou fotometra. Stupeň optickej hustoty bude nepriamo úmerný koncentrácii skúmaných Ag HBs.

Reakcia prebieha v troch fázach:

1. HBs Ag testovaného séra (plazmy) sa viaže na homologické protilátky adsorbované na povrchu jamky. Vytvorí sa IR AG-AT. (HBs Ag – anti HBs AT).

2. Protilátky proti HBs Ag, značené peroxidázou, sa viažu na zvyšné voľné determinanty HBs Ag v komplexe AG-AT. Vzniká komplex AT-AG značených AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT, značené peroxidázou).

3. OPD interaguje s peroxidázou komplexu AT-AG-AT a dochádza k žltému sfarbeniu.

B) nepriamy typ

Je to hlavná testovacia reakcia na diagnostiku infekcie HIV.

Účel: Sérologická diagnostika HIV infekcie – detekcia protilátok proti HIV antigénom.

Komponenty:

1) testovací materiál – krvné sérum (AT až HIV Ags);

2) syntetické peptidy imitujúce 2 HIV antigény: gp 120 a gp 41, adsorbované na povrchu polystyrénovej jamky;

3) antiglobulínové sérum značené peroxidázou, získané imunizáciou králikov ľudskými globulínmi (AT až AT);

5) fyziologický roztok pufrovaný fosfátom;

6) kontrolné séra:

Pozitívny;

Negatívne.

Pokrok:

1. Pridanie kontrolných a testovacích sér.

2. Inkubácia počas 30 minút pri 37 °C.

3. Pranie.

4. Pridanie antiglobulínového séra označeného enzýmom.

5. Inkubácia počas 30 minút pri 37 °C.

6. Pranie.

7. Zadanie OFD.

Reakcia prebieha v 3 fázach:

1. Protilátky testovaného séra proti HIV sa viažu na homológne antigény (gp 120 a gp 41) a na povrchu sorbentu sa tvorí IR AG-AT (HIV Ag - AT na HIV).

2. Tvorba IR AG-AT-AT, značeného peroxidázou, pretože Protilátky testovacieho séra sú antigény pre antiglobulínové sérum.

3. OPD interaguje s peroxidázou komplexu AG-AT-AT a dôjde k žltému sfarbeniu roztoku v jamke. Stupeň enzymatickej aktivity je priamo úmerný koncentrácii testovaných protilátok.

č. 35 Imunofluorescenčná reakcia. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.
Imunofluorescenčná metóda (RIF, imunofluorescenčná reakcia, Coonsova reakcia) je metóda na detekciu špecifických antigénov pomocou protilátok konjugovaných s fluorochrómom. Má vysokú citlivosť a špecifickosť.
Používa sa na expresnú diagnostiku infekčných ochorení (identifikácia patogénu v testovanom materiáli), ako aj na stanovenie AT a povrchových receptorov a markerov leukocytov (imunofenotypizácia) a iných buniek.
Detekcia bakteriálnych a vírusových antigénov v infekčných materiáloch, živočíšnych tkanivách a bunkových kultúrach pomocou fluorescenčných protilátok (sér) má široké využitie v diagnostickej praxi. Príprava fluorescenčných sér je založená na schopnosti určitých fluorochrómov (napríklad fluoresceín izotiokyanát) vstúpiť do chemickej väzby so sérovými proteínmi, bez narušenia ich imunologickej špecifickosti.
Existujú tri typy metód: priama, nepriama, s doplnkom. Priama metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž obvodu bunky vo forme zeleného okraja.
Nepriama metóda RIF spočíva v identifikácii komplexu antigén-protilátka pomocou antiglobulínového (protilátkového) séra označeného fluorochrómom. Na tento účel sa nátery zo suspenzie mikróbov ošetria protilátkami z antimikrobiálneho králičieho diagnostického séra. Potom sa protilátky, ktoré nie sú naviazané na mikrobiálne antigény, premyjú a protilátky zostávajúce na mikróboch sa detegujú ošetrením náteru antiglobulínovým (antikráličím) sérom značeným fluorochrómami. V dôsledku toho sa vytvorí komplex mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + anti-králičie protilátky značené fluorochrómom. Tento komplex sa pozoruje vo fluorescenčnom mikroskope, ako pri priamej metóde.
Mechanizmus . Rozter testovaného materiálu sa pripraví na podložné sklíčko, fixuje sa na plameň a ošetrí sa imúnnym králičím sérom obsahujúcim protilátky proti antigénom patogénov. Na vytvorenie komplexu antigén-protilátka sa liek umiestni do vlhkej komory a inkubuje sa pri 37 °C po dobu 15 minút, potom sa dôkladne premyjú izotonickým roztokom chloridu sodného, ​​aby sa odstránili protilátky, ktoré sa nenaviazali na antigén. Potom sa na prípravok aplikuje fluorescenčné antiglobulínové sérum proti králičím globulínom, inkubuje sa 15 minút pri 37 °C a potom sa prípravok dôkladne premyje izotonickým roztokom chloridu sodného. V dôsledku naviazania fluorescenčného antiglobulínového séra so špecifickými protilátkami fixovanými na antigén vznikajú svetielkujúce komplexy antigén-protilátka, ktoré sa detegujú fluorescenčnou mikroskopiou.

Imunofluorescenčná reakcia (RIF) je sérologická reakcia, ktorá umožňuje detekciu protilátok proti známym antigénom. Metóda zahŕňa mikroskopiu zafarbených náterov.

Táto reakcia sa využíva v imunológii, virológii a mikrobiológii. Umožňuje určiť prítomnosť vírusov, baktérií, húb, prvokov a ICC. RIF je veľmi široko používaný v diagnostickej praxi na detekciu vírusových a bakteriálnych antigénov v infekčnom materiáli. Metóda je založená na schopnosti fluorochrómu viazať sa na proteíny bez narušenia ich imunologickej špecifickosti. Používa sa hlavne pri diagnostike infekcií močových ciest.

Existujú nasledujúce metódy na uskutočnenie imunofluorescenčnej reakcie: priama, nepriama, s komplementom. Priama metóda zahŕňa farbenie materiálu fluorochrómmi. Vďaka schopnosti mikrobiálnych alebo tkanivových antigénov žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu sú definované ako bunky s jasne sfarbeným zeleným okrajom.

Nepriama metóda zahŕňa stanovenie komplexu antigén+protilátka. Na tento účel sa experimentálny materiál ošetrí protilátkami z antimikrobiálneho králičieho séra určeného na diagnostiku. Potom, čo sa protilátky naviažu na mikróby, sú oddelené od tých, ktoré sa nenaviazali, a ošetrené fluorochrómom označeným protikráličím sérom. Potom sa pomocou ultrafialového mikroskopu stanoví komplex mikrób + animikrobiálne protilátky + protilátky proti králikom rovnakým spôsobom ako pri priamej metóde.

Imunofluorescenčná reakcia je pri diagnostike syfilisu nevyhnutná. Pod vplyvom fluorochrómu je pôvodca syfilisu identifikovaný ako bunka so žltozeleným okrajom. Neprítomnosť luminiscencie znamená, že pacient nie je infikovaný syfilisom. Tento test sa často predpisuje na pozitívnu Wassermanovu reakciu. Táto metóda je veľmi účinná pri diagnostike, pretože umožňuje identifikovať patogén v počiatočných štádiách ochorenia.

Okrem toho, že RIF umožňuje diagnostikovať syfilis, používa sa aj na určenie prítomnosti patogénov, ako sú chlamýdie, mykoplazmy, trichomóny, ako aj patogénov kvapavky a genitálneho herpesu.

Na analýzu sa používajú nátery alebo venózna krv. Postup pri odbere náteru je úplne bezbolestný a nepredstavuje žiadne nebezpečenstvo. Na túto analýzu je potrebné sa pripraviť. Dvanásť hodín predtým sa neodporúča používať hygienické výrobky, ako sú malo alebo gély. Niekedy sa podľa pokynov lekára vykonáva aj provokácia. K tomu sa odporúča piť pikantné jedlo alebo alkohol, prípadne injekčne podať provokatívnu látku, ako je gonovakcína alebo pyrogenal. Okrem toho interval medzi užitím antibakteriálnych liekov a vykonaním testu musí byť najmenej štrnásť dní.

Pri hodnotení výsledkov je potrebné vziať do úvahy skutočnosť, že luminiscencia sa pozoruje nielen u živých baktérií, ale aj u mŕtvych, čo platí najmä pre chlamýdie. Po kurze antibiotík žiaria aj mŕtve bunky chlamýdií.

Pri správnej príprave pacienta a dodržiavaní techniky odberu náterov vám táto analýza umožňuje identifikovať choroby v počiatočných štádiách, čo je veľmi dôležité pre včasnú liečbu. Pozitívnymi aspektmi tejto metódy sú krátky čas na získanie výsledkov, jednoduchá implementácia a nízke náklady na analýzu.

Medzi nevýhody patrí skutočnosť, že na vykonanie analýzy je potrebné pomerne veľké množstvo testovacieho materiálu. Okrem toho by mal výsledky hodnotiť iba skúsený odborník.