الأدوية القائمة على أليغنوكليوتيدات. مضادات النوكليوتيدات "أليغنوكليوتيد كأدوية

قليل النوكليوتيد هو قطعة قصيرة من الحمض النووي يقل طولها عن 50 نيوكليوتيد. خلال العشرين عامًا الماضية ، توسع المعنى ليشمل جميع الأحماض النووية المُصنّعة كيميائيًا ، بغض النظر عن طولها. ظهر أول منشور عن التوليف الكيميائي المستهدف للقليل النوكليوتيد في عام 1955.

منذ ذلك الحين ، تم تصنيع الملايين من قليل النوكليوتيدات كل عام لاستخدامها في المختبرات حول العالم. تتطلب معظم الدراسات كميات صغيرة فقط من الحمض النووي. هناك حاجة إلى كميات أكبر بكثير من الحمض النووي (10 ميكرولتر أو أكثر) لاستخدامها في الدراسات الفيزيائية الحيوية (الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية) ، لذلك من أجل السماح بتوليف مثل هذه الكميات الكبيرة ، تم تطوير طرق تخليق المرحلة الصلبة التي تسمح بالاستخدام من oligonucleotides كجزيئات دواء (على سبيل المثال ، oligonucleotides antisense).

يشير تخليق أليغنوكليوتيدات DNA أو RNA إلى التوليف الكيميائي لشظايا الحمض النووي ذات الهياكل الكيميائية المحددة أو التسلسلات بأحجام مختلفة.

رسم بياني 1. تراكيب قليل النوكليوتيدات.

تم تطوير مبدأ تخليق المرحلة الصلبة لأول مرة وتطبيقه على تخليق عديد الببتيد بواسطة روبرت بروس ميريفيلد ، عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي الذي حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1984 لاختراعه تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة. لقد أدرك أن مفتاح التوليف الناجح هو تثبيت المونومر الأول على المادة الصلبة البوليمرية غير القابلة للذوبان. يمكن بعد ذلك توصيل المونومرات الأخرى ، واحدًا تلو الآخر ، بالنهاية الطرفية الثابتة للبوليمر النامي. في نهاية التوليف ، يمكن فصل سلسلة البوليمر المكتملة عن البوليمر غير القابل للذوبان وتنقيتها. تم تحسين هذه العملية على مر السنين لتكون عالية الكفاءة وأصبحت الآن تقنية أساسية مستخدمة في أجهزة توليف قليلة النوكليوتيد الآلية.

لضمان التوليف الناجح لأوليغنوكليوتيدات ، فإن الشروط التالية ضرورية:

• يجب أن تكون جميع الكواشف قابلة للذوبان في مذيبات غير مائية.
• يجب سد مجموعات الأمينية والهيدروكسيل لقواعد النوكليوتيدات وبقايا الكربوهيدرات بشكل مناسب.
• يجب أن تكون مجموعات الحماية التي يتم إدخالها أثناء التخليق مستقرة في ظل ظروف استطالة السلسلة أثناء تكوين رابطة فوسفوديستر بين النوكليوتيدات.
• يجب أن تكون مجموعات الحماية قابلة للتسمية بدرجة كافية بحيث يمكن إزالتها في نهاية التخليق دون الإضرار بمنتجات التفاعل.

وظائف قليل النوكليوتيدات وآفاق تطبيقها

حاليًا ، تُستخدم أليغنوكليوتيدات ونظائرها على نطاق واسع في مختلف المجالات ، مثل الطب وأبحاث البيولوجيا الجزيئية ، وتعتبر أيضًا عوامل علاجية واعدة وتحقيقات للتشخيص الجزيئي.

على مدار العشرين عامًا الماضية ، تمت دراسة نوعين فقط من نظائر الحمض النووي ذات العمود الفقري المحايد كهربائيًا بشكل جيد نسبيًا: الأحماض النووية الببتيدية و phosphorodiamide morpholino oligonucleotides. النظائر من كلا النوعين قادرة على الارتباط التكميلي مع جزيئات الحمض النووي الريبي الطبيعي والحمض النووي الريبي ، وبالتالي فقد وجدت تطبيقًا في كل من البيولوجيا الجزيئية ، وعلى وجه الخصوص ، في الطب كأدوية محتملة.

بالإضافة إلى ذلك ، مع تطور تقنيات الحمض النووي ، أصبح من الممكن دراسة التعبير عن الجينات المعروفة ، وتحديد الطفرات في جينومات الكائنات الحية المختلفة ، وتشخيص عدد من الأمراض المعدية. في حل هذه المشكلات ، فإن أكثر الأمور الواعدة هو استخدام رقائق الحمض النووي ، وهي عبارة عن صفائح صغيرة بها أجزاء من الحمض النووي المترسبة على سطحها.

تجمع طريقة إنشاء رقائق الحمض النووي بين الأساليب القائمة على التخليق المستهدف للقليل النوكليوتيدات مباشرة على سطح الرقاقة. يتم التوليف عن طريق إضافة تدريجية إلى سلسلة النوكليوتيدات المتنامية التي تحتوي على مجموعة واقية قابلة للتغير في نهاية 5'، والتي يمكن إزالتها تحت تأثير الإشعاع الخفيف ، أو الجهد الكهربائي ، أو أثناء التحلل المائي الحمضي.

وقد ثبت أيضًا ، اعتمادًا على الجين المستهدف المختار ، أن قليل النوكليوتيدات المستهدفة للجينات لها مجموعة متنوعة كبيرة من التأثيرات المعدلة على أنسجة الورم ، بدءًا من إبطاء ووقف تكاثر الخلايا السرطانية وانتهاءً بقمع خصائصها الغازية.

الأدوية المضادة للسرطان التي تعتمد على الأحماض النووية هي أداة محددة للغاية لتعديل التعبير الجيني. يمكن تحقيق قمع عدد من الجينات المفرطة التعبير بشكل غير طبيعي أثناء التحول الورمي باستخدام الأدوية القائمة على الحمض النووي مثل oligonucleotides المضادة للحساسية (asONs). بشكل عام ، تتمثل آلية قمع التعبير الجيني في ارتباطها التكميلي بـ mRNA الهدف ، وبعد ذلك يتم شق mRNA الهدف أو يتم حظر عملية ترجمته.

أسون عبارة عن دنا اصطناعية أحادية الجديلة بطول 15-20 نيوكليوتيدات. في الآونة الأخيرة ، تم الحصول على asONs التي يمكن أن تمنع نقل mRNA المقسم من النواة إلى السيتوبلازم ، وكذلك asONs ، والتي ، نتيجة لمنع موقع الربط في pre-mRNA ، يمكن أن تؤدي إلى التعبير عن البديل البروتيني.

نظرًا لحقيقة أن oligodeoxyribonucleotides الطبيعية في زراعة الخلايا وتحت ظروف الجسم الحي تخضع لتدهور سريع تحت تأثير nucleases ، يتم إدخال تعديلات كيميائية مختلفة في بنية asON لزيادة ثباتها.

التوليف الكيميائي لأوليغنوكليوتيدات

يستخدم تخليق الطور الصلب على نطاق واسع في تخليق الببتيد ، تخليق قليل النوكليوتيد ، تخليق قليل السكاريد ، والكيمياء التوافقية. اخترع بروس ميريفيلد التركيب الكيميائي للحالة الصلبة في الستينيات ، وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1984.

يتم تصنيع الطور الصلب على دعامة صلبة ، بين المرشحات ، في أعمدة تسمح لجميع الكواشف والمذيبات بالمرور. يحتوي تخليق الطور الصلب على عدد من المزايا مقارنة بتوليف المحلول:

 يوفر معدل تفاعل عالي

 يتم غسل الشوائب والمواد الكاشفة الزائدة ، لذلك لا يلزم التنظيف بعد كل خطوة

 العملية قابلة للتشغيل الآلي على أجهزة تصنيع الطور الصلب التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر.

المواد الحاملة الصلبة (وتسمى أيضًا الراتنجات) عبارة عن جسيمات غير قابلة للذوبان في الماء ، يبلغ قطرها عادة 50-200 ميكرومتر ، والتي يتم ربط قليل النوكليوتيد بها أثناء التخليق.

هناك أدلة على أن الزجاج المسامي هو أحد أكثر المواد فعالية التي يمكن استخدامها كدعم صلب. إنه جامد تمامًا وغير قادر على التورم. يحدث تخليق قليل النوكليوتيدات في مسامها العميقة. يحتوي الزجاج على 500 درجة مئوية (50 نانومتر) من المسام ، وهي مناسبة لتركيب قليل النوكليوتيدات القصيرة. ومع ذلك ، فهي غير مناسبة بشكل جيد لتركيب أليغنوكليوتيدات أكثر من 40 قاعدة في الطول. هذا يرجع إلى حقيقة أن قليل النوكليوتيد المتنامي يسد المسام ويقلل من انتشار الكواشف عبر المصفوفة.

تُصنع الدعامات الصلبة لتخليق قليل النوكليوتيدات التقليدي عادةً بتحميل 20-30 ميكرولتر نيوكليوسيد لكل جرام من الراتنج. يصبح تخليق قليل النيوكليوتيدات عند الأحمال العالية أقل كفاءة بسبب العائق الفاصل بين خيوط الحمض النووي المجاورة المرتبطة بالراتنج.

مراحل التركيب الكيميائي للقليل النوكليوتيدات

يستمر تخليق أوليجو الفوسفوراميدات في الاتجاه من 3 إلى 5 (عكس اتجاه 5 إلى 3 'للتخليق الحيوي للحمض النووي في تكرار الحمض النووي). يضاف نوكليوتيد واحد لكل تخليق دورة.

أرز. 2. دورة تخليق أليغنوكليوتيد الفوسفوراميدات

في بداية تخليق قليل النوكليوتيد ، يتم توصيل النيوكليوسيد الأول مسبقًا بالراتنج (الناقل) ويتم اختيار أعمدة التوليف A أو G أو C أو T اعتمادًا على النيوكليوسيد في الطرف 3 من قليل النوكليوتيد المطلوب. يحتوي النيوكليوسيد المثبت على مجموعة حماية 5'-DMT (DMT = 4،4'-dimethoxytrityl) والتي يتمثل دورها في منع البلمرة ويجب إزالة مجموعة الحماية هذه (إزالة الترسبات). تظهر آلية إلغاء المحاكمة في الشكل 3.

تين. 3. حماية آلية إزالة المجموعة.

بعد إزالة الترسبات ، يكون النيوكليوسيد المثبت جاهزًا للتفاعل مع القاعدة التالية ، والتي تتم إضافتها كمونومر فوسفوراميدي نيوكليوزيد. يتم خلط فائض كبير من النيوكليوسيد المقابل مع المنشط (تترازول أو مشتقاته). يتم بروتون مجموعة ثنائي إيزوبروبيلامينو للنيوكليوسيد بواسطة المنشط ، وبالتالي تصبح مجموعة قابلة للفصل بشكل كبير. يتم إزاحته سريعًا بواسطة مجموعة 5′-hydroxyl من النيوكليوسيد المرتبط ، مما يؤدي إلى تكوين ثلاثي الفوسفات (الشكل 4).

الشكل 4. آلية البروتون بواسطة المنشط.

النيوكليوزيد الفوسفوراميديت مستقرة تمامًا في جو خامل ، ويمكن إنتاجها بكميات كبيرة ، وشحنها في جميع أنحاء العالم ، وتخزينها كمادة صلبة جافة لعدة أشهر قبل الاستخدام.

ومع ذلك ، حتى مع عمل تخليق قليل النوكليوتيد عالي الدقة ، لا يزال هناك احتمال وجود عدد قليل من مجموعات 5′-هيدروكسيل غير المتفاعلة والتي ستكون متاحة للمشاركة في المرحلة التالية. إذا لم يتم إيقاف هذا الاضطراب ، فسوف يتراكم مع كل دورة لاحقة ، وسيكون المنتج النهائي عبارة عن خليط معقد من قليل النيوكليوتيدات ، والذي سيحمل معظمه معلومات وراثية غير صحيحة.

لذلك ، فإن طريقة الأستلة لمجموعات 5-hydroxyl تجعلها خاملة فيما يتعلق بالتفاعل اللاحق. هذا ضروري أيضًا لتقليل الشوائب.

الفوسفيت الثلاثي (P (III)) المتكون في خطوة الإضافة غير مستقر للأحماض ويجب تحويله إلى الشكل المستقر (P (V)). يتم تحقيق ذلك بسبب أكسدة اليود في وجود الماء والبيريدين (الشكل 5). إن الفوسفوتريستر الناتج هو في الواقع محور DNA محمي بواسطة مجموعة 2-cyanoethyl. تمنع مجموعة cyanoethyl التفاعلات غير المرغوب فيها مع الفوسفور أثناء دورات التخليق اللاحقة.

الشكل 5. آلية المرحلة المؤكسدة.

بعد ذلك ، يجب إزالة مجموعة الحماية DMT في نهاية 5 'من حبلا DNA بحيث يمكن لمجموعة الهيدروكسيل الأولية أن تتفاعل مع nucleotide phosphoramidate التالي. تفاعل نزع الحماية مع حمض ثلاثي كلورو أسيتيك في ثنائي كلورو ميثان سريع. تتكرر الدورة ، مرة واحدة لكل قاعدة ، حتى يتم الحصول على قليل النوكليوتيد المطلوب.

بعد ذلك ، تحتاج إلى فصل أليغنوكليوتيد المركب من الدعامة الصلبة. في هذه الحالة ، يتم استخدام السكسينيل. يمكن الفصل عند معالجته بأمونيا مائية مركزة عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة (الشكل 6).

الشكل 6. آلية فصل قليل النوكليوتيد عن مادة حاملة صلبة في محلول أمونيا مائي مركز.

يتم تنفيذ تفاعل الانقسام تلقائيًا على بعض أجهزة التصنيع ، ويدخل محلول الأمونيا المحتوي على قليل النوكليوتيد في قارورة زجاجية. بدلاً من ذلك ، يمكن إجراء عملية الهضم يدويًا عن طريق أخذ العمود من المركب والشطف في محاقن تحتوي على هيدروكسيد الأمونيوم.

يتم إذابة قليل النوكليوتيد في أمونيا مائية مركزة ، ويسمح التسخين اللاحق بإزالة مجموعات الحماية من القواعد الحلقية غير المتجانسة والفوسفات. ثم تتم إزالة المحلول المائي عن طريق التبخر ويكون قليل النوكليوتيد جاهزًا للتنقية.

بالإضافة إلى مجموعة الحماية DMT ، هناك حاجة أيضًا إلى مجموعات حماية إضافية للأدينين والسيتوزين والجوانين (الشكل 7). ومع ذلك ، هذا ليس ضروريا للثيمين.

الشكل 7. تُستخدم هياكل مجموعة الحماية بشكل شائع لحماية قواعد الأدينين والسيتوزين والجوانين أثناء تخليق الفوسفوراميدات لأوليغنوكليوتيدات الحمض النووي.

الاستنتاجات

1. يتزايد استخدام الأوليغنوكليوتيدات المُصنَّعة صناعياً في مختلف مجالات العلوم ، كما يجري تحسين طرق تحضيرها بشكل متزايد ، مما يجعل من الممكن تصنيع عدد كافٍ من قليل النيوكليوتيدات لإجراء التجارب المعملية ولإنشاء العقاقير العلاجية.

2. حتى الآن ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا لتخليق قليل النيوكليوتيدات هي طريقة تخليق المرحلة الصلبة ، والتي يمكن أن تسرع بشكل كبير عملية الحصول على قليل النوكليوتيدات ، وكذلك تقليل كمية الكواشف المستهلكة.

دواء للجينات

حلم الأطباء منذ فترة طويلة هو أن يكون لديهم تحت تصرفهم مواد من شأنها أن تؤثر على جينات معينة ، أي السبب الجذري للعديد من الأمراض. في الواقع ، بناءً على هذه المواد ، من الممكن إنتاج أدوية - "رصاصات سحرية" حقيقية يمكن أن تؤثر على المادة الوراثية لمختلف العوامل المعدية دون الإضرار بجسم الإنسان ، وكذلك قمع نشاط الجينات المسرطنة المسؤولة عن نمو الخلايا الخبيثة. يعد إنشاء مثل هذه المواد التي لها تأثير مباشر على المادة الوراثية إحدى المهام الرئيسية للبيولوجيا الجزيئية ، حيث يمكن استخدامها لدراسة وظائف الجينات ، وفي النهاية التحكم في عمل الأخير.

لكن كيف يمكنك تغيير البرنامج الجيني المرغوب؟ بعد كل شيء ، كل الجينات لها تركيبة وبنية كيميائية متشابهة: يتم تقليل الاختلافات بينها فقط إلى ترتيب تناوب أربع كتل أحادية - نيوكليوتيدات A ، T ، G ، C من أجل العمل على جين معين ، جزيء مادة يجب أن يتعرف بطريقة ما على تسلسل النوكليوتيدات هذا - المهمة ، للوهلة الأولى ، غير قابلة للحل.

لكن مجموعة من الكيميائيين السيبيريين الذين أتوا إلى أكاديمية نوفوسيبيرسك في السنوات الأولى من إنشائها اعتقدوا عكس ذلك. صاغ موظفو معهد الكيمياء العضوية التابع لفرع سيبيريا لأكاديمية العلوم في اتحاد الجمهوريات الاشتراكية السوفياتية (نوفوسيبيرسك) ن. قليل النوكليوتيدات - شظايا الحمض النووي "المسلحة" بمجموعات كيميائية خاصة. نشر الكيميائيون السيبيريون أول عمل عن أليغنوكليوتيدات في عام 1967 - ويعتبر هذا التاريخ اليوم هو التاريخ الرسمي لظهور اتجاه جديد في البيولوجيا الجزيئية والصيدلة.

كانوا الأوائل

تم تنفيذ هذا المشروع ، غير المعتاد في جرأته (في ذلك الوقت ، لم يكن من المخطط حتى إجراء مثل هذا البحث في أي مكان في العالم) في المرحلة الأولية من قبل مجموعة صغيرة من الموظفين الشباب وطلاب الدراسات العليا وطلاب NSU. كان علينا أن نبدأ عمليًا من الصفر ، لأنهم في ذلك الوقت ما زالوا لا يعرفون كيف يصنعون أليغنوكليوتيدات بكميات ملحوظة ؛ لم تكن هناك أدوات تقنية ضرورية للعمل مع كميات صغيرة من الأحماض النووية وطريقة فعالة لتحديد تسلسلها. تمكن الكيميائيون لدينا من حل هذه المشكلات بفضل تعدد التخصصات - وهو أحد المبادئ التي شكلت أساس أنشطة فرع سيبيريا.

نظمت شركة النفط الوطنية الإيرانية (NIOC) إنتاج الأحماض النووية وطرق تطويرها لتعديلها الكيميائي ؛ بالاشتراك مع موظفي معهد الفيزياء النووية ، كان من الممكن إنشاء أجهزة لتحليل الأحماض النووية والتلاعب بكمياتها الصغيرة ، جنبًا إلى جنب مع كيميائيين في جامعة موسكو الحكومية - لتطوير العمل على إنشاء مُصنِّع آلي لـ قليل النوكليوتيدات. ونتيجة لذلك ، كانت جميع الأساليب والأدوات التحليلية اللازمة عمليًا تحت تصرف العلماء - ويمكن أن يبدأ البحث البيولوجي.

أظهرت التجارب التي أجريت أولاً على نماذج بسيطة ثم على الأحماض النووية الطبيعية أن قليلات النوكليوتيدات تتفاعل بالفعل مع الأحماض النووية المستهدفة بدرجة عالية من الانتقائية. في حالة ارتباط المجموعات التفاعلية بالأوليغنوكليوتيدات ، يحدث تعديل كيميائي مستهدف للأحماض النووية المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، فقد تم إثبات لأول مرة أن هذه الكواشف يمكن استخدامها لقمع العدوى الفيروسية في الحيوانات ، وقد تم إثبات إمكانية إدخالها إلى الجسم من خلال الجلد والأغشية المخاطية ، وما إلى ذلك.

أثارت المنشورات المبكرة عن التأثيرات البيولوجية التي تنتجها أليغنوكليوتيدات اهتمامًا كبيرًا بين المتخصصين في جميع أنحاء العالم. في عام 1988 ، عُقدت الندوة الأولى في العالم حول المواد المستهدفة للجينات القائمة على شظايا الحمض النووي في أكاديمغورودوك. انضم علماء من الولايات المتحدة وفرنسا ومن ثم دول أخرى إلى العمل على إنشاء مثل هذه الأدوية ؛ ظهرت العشرات من الشركات بهدف إنشاء عقاقير علاجية تعتمد على أليغنوكليوتيدات.

الطب التكميلي

أصبح ما يسمى oligonucleotides antisense ، المصمم للتثبيط الانتقائي للحمض النووي الريبي الفيروسي وبعض الحمض النووي الريبي الخلوي ، أول الأدوية التي تستهدف الجينات. في البداية ، كان من المفترض أن المجموعات التفاعلية سوف ترتبط بهذه الأوليغنوكليوتيدات ، والتي يجب أن تعدل أو تدمر كيميائيا الأحماض النووية المستهدفة. ومع ذلك ، فقد اتضح أن ارتباط قليل النوكليوتيدات بالحمض النووي الريبي المستهدف بحد ذاته له تأثير قوي عليه لدرجة أنه يمكن أن يؤدي إلى تدميره بواسطة الإنزيمات الخلوية.

تقدم مناهج مضادات المعنى القائمة على استخدام النيوكليوتيدات والأحماض النووية لقمع النشاط البيولوجي للأحماض النووية آفاقًا مثيرة للاهتمام في الحالات التي يكون فيها من الضروري قمع تنفيذ المعلومات غير المرغوب فيها في الكائنات الحية. بادئ ذي بدء ، تفتح آفاق إنشاء جيل جديد من الأدوية المضادة للفيروسات والأورام. تتمتع هذه الأدوية بميزة واحدة لا جدال فيها على غيرها ... يمكن إنشاء جميع قليل النوكليوتيدات ، بغض النظر عن الهدف الذي تستهدفه ، باستخدام تقنية واحدة. فقط تسلسل النيوكليوتيدات يحتاج إلى التغيير. على وجه الخصوص ، في علم الفيروسات وعلم الأورام ، غالبًا ما يتعين على المرء أن يتعامل مع ظاهرة مثل ظهور مقاومة الأدوية. يحدث هذا غالبًا لأن جسيم فيروس واحد أو خلية سرطانية واحدة بها طفرة تؤدي إلى هذه المقاومة. في أي حالة أخرى ، يجب البدء في البحث التجريبي عن عقار جديد. في حالة التأثيرات المضادة للدلالة ، من الضروري فقط تحديد التغيير في بنية الجينوم الفيروسي أو الجين الورمي الذي أدى إلى ظهور المقاومة. بعد ذلك ، يتضح على الفور كيفية إنشاء عقار جديد باستخدام نفس التقنية الموحدة *.

* مجلة سوروس التعليمية. - 1998. - 12. - م 25-31.

اتضح أن الحمض النووي الريبي المتداخل ، وهو مركبات قصيرة مزدوجة الشريطة من أليغنوكليوتيدات الرنا ، هي أقوى وسيلة "لإيقاف" الجينات. عندما يتم إدخال مثل هذا المركب في خلية ، يرتبط أحد الخيوط بتسلسله التكميلي في رسول RNA للخلية. هذا بمثابة إشارة لبدء عمل مجموعة من الإنزيمات التي تقطع الحمض النووي الريبي المرتبط بأوليغنوكليوتيدات. نتيجة لذلك ، يختفي برنامج تخليق بروتين معين.

في عام 2006 ، حصل باحثان أمريكيان على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب لشرح آلية تداخل الحمض النووي الريبي. لقد فتح إنشاء منظمات التعبير الجيني القائمة على تدخل الحمض النووي الريبي فرصًا كبيرة للحصول على مجموعة واسعة من الأدوية غير السامة عالية الفعالية التي تثبط التعبير عن جميع الجينات تقريبًا ، بما في ذلك الورم والفيروسات.

الطفرات الصحيحة

لطالما جذب انتباه المتخصصين طرق العمل المطفر على الحمض النووي باستخدام أليغنوكليوتيدات أو مشتقاتها. إذا نجحت ، فإن ما يبدو اليوم وكأنه خيال قد يصبح حقيقيًا: تصحيح البرامج الجينية المعيبة.

لقد ثبت بالفعل تجريبياً أن الطفرات النقطية يمكن إدخالها في البرامج الجينية باستخدام أليغنوكليوتيدات قصيرة. كيف افعلها؟ يتم إدخال قليل النوكليوتيدات المطفرة التي تحتوي على كتل نيوكليوتيد "خاطئة" في الخلية ، حيث يتم دمجها مع الحمض النووي. نتيجة لذلك ، تظهر أزواج القاعدة "الخاطئة" ، أي غير التكميلية ، في بعض أجزاء متواليات النيوكليوتيدات ، والتي ينظر إليها نظام إصلاح الحمض النووي الخلوي ("الإصلاح") على أنها تلف. يتم استبدال النيوكليوتيدات في مثل هذا الزوج بإنزيمات تعويضية بحيث تصبح "صحيحة" ومكملة. في هذه الحالة ، يمكن أن يحدث الاستبدال في كل من تسلسل قليل النوكليوتيد وفي الحمض النووي الخلوي نفسه.

في الحالة الأخيرة ، نحن نتعامل مع تغيير في البرنامج الجيني ، أي مع طفرة. وعلى الرغم من أن كفاءة عملية الطفرة هذه منخفضة بشكل عام ، إلا أنه يمكن استخدامها فيما يتعلق بالتقنيات الخلوية الجديدة. على سبيل المثال ، يمكن علاج الخلايا الجذعية لمريض يعاني من بعض الاضطرابات الوراثية بمطفر انتقائي ، ومن ثم يمكن اختيار الخلايا التي حدثت فيها الطفرة المرغوبة (أي الخلايا ذات البرنامج الجيني "المصحح") ، تتكاثر وتدخل في الجسم.

وبالتالي ، فإن قليل النوكليوتيدات الموجودة حاليًا قادرة على تنظيم "عمل" الجينات على مستويات مختلفة. وهكذا ، فإن oligonucleotides المذكورة أعلاه المضادة للحساسية والحمض النووي الريبي المتداخل تعمل في مرحلة تخليق البروتين ، وتعمل على الرنا المرسال - جزيئات المعلومات التي يتم فيها تجميع سلاسل البولي ببتيد. قليل النوكليوتيدات المستضدية التي تشكل معقدات مع الحمض النووي تقوم بتثبيط التعبير الجيني - تكوين الحمض النووي الريبي المرسال نفسه ، ويمكن أن تشكل أليغنوكليوتيدات aptamer ، مثل الأجسام المضادة ، روابط مع بروتينات معينة ، مما يمنعها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض النكليوتيدات قادرة على تحفيز جهاز المناعة - وهي تستخدم اليوم كمكونات للقاحات.

في الوقت الحاضر ، يتم تطوير وتوليف قليل النوكليوتيدات ونظائرها بواسطة قطاعات بحثية وصناعية كبيرة. لذلك ، تجاوز حجم سوق قليل النوكليوتيدات المخصص للأغراض البحثية وحدها في العام الماضي 800 مليون دولار! تم الآن تطوير وتصنيع العشرات من الأنواع الجديدة من قليل النوكليوتيدات المعدلة كيميائيًا ، ويتم اختبار عدد من الأدوية المضادة للفيروسات والالتهابات القائمة عليها. يتم إجراء هذا النوع من الأبحاث في روسيا حاليًا بشكل رئيسي في معهد البيولوجيا الكيميائية والطب الأساسي التابع لفرع سيبيريا التابع لأكاديمية العلوم الروسية ، حيث يعمل الطلاب وأتباع الأكاديمي D.G Knorre.

هكذا أثبتت الحياة نفسها خصوبة الفكرة التي نشأت في فرع سيبيريا قبل أربعين عامًا. باستخدام أجزاء قصيرة من الأحماض النووية كتركيبات أساسية لتكوين مواد نشطة بيولوجيًا تستهدف الجينات ، من الممكن تطوير أدوية محددة وإدخالها بسرعة في الإنتاج ضد أي فيروس تقريبًا. للقيام بذلك ، من الضروري فقط فك شفرة تسلسل النوكليوتيدات للجينات الفيروسية ، وهو أمر يسهل القيام به بمساعدة التقنيات الحديثة. هذا النهج الشامل له مستقبل عظيم: تسمح لنا نتائج الدراسات الحديثة ، ولا سيما على الطفرات الموجهة بالموقع ، بالاعتماد على ظهور عقاقير فعالة في المستقبل القريب لمكافحة الأمراض التي لا تزال تعتبر غير قابلة للشفاء.

ملخص

تأخذ المراجعة في الاعتبار الخصائص الحركية الدوائية لمختلف مستحضرات قليل النوكليوتيد المضادة للحساسية. تمت مقارنة الحرائك الدوائية للأدوية من الجيل الأول والثاني. واعتبروا أيضًا تأثير التعديل الكيميائي للجزيء على الحرائك الدوائية.

الكلمات الدالةالكلمات الأساسية: أليغنوكليوتيدات مضادة المعنى ، أليغوديوكسينوكليوتيدات الفوسفاتي ، الحرائك الدوائية

مقدمة

تصبح الخصائص الحركية الدوائية لأوليغنوكليوتيدات مضادات المعنى (ASOs) مفهومة بشكل أفضل عند النظر في خصائصها الفيزيائية والكيميائية. المعلمات مثل الشحنة والوزن الجزيئي والطبيعة amphipathic من ACOs الفوسفوثيوات لها تأثير ملحوظ على الحرائك الدوائية. التركيب الكيميائي ، على وجه الخصوص ، مجموعة الفوسفوثيوات و 2'-ميثوكسي إيثيل (MOE) ، له تأثير كبير بشكل خاص على خصائص الحرائك الدوائية لـ ASO.

تمت دراسة الامتصاص ، والتوزيع ، والتمثيل الغذائي ، وإفراز الجيل الأول من فوسفوثيوات أليغودوكسينوكليوتيدات (ODNs) على نطاق واسع في حيوانات المختبر وفي الدراسات السريرية. خصائص الحرائك الدوائية لتحضيرات ASO الفوسفوتية هي كما يلي: يجد ODN الفوسفوثيوات المعطى بالحقن نفسه بسرعة في بلازما الدم ، حيث يرتبط بالمناطق المحبة للماء لبروتينات البلازما وبالتالي تجنب الترشيح الكبيبي. تتميز هذه المناطق المحبة للماء عن المناطق المحبة للماء الأخرى التي ترتبط بها الأدوية المحبة للدهون ، وبالتالي هناك القليل من المنافسة على ارتباط بروتين البلازما بـ ASO. تتميز حركيات البلازما بمرحلة توزيع قصيرة (في حدود عدة ساعات) تليها مرحلة التخلص مع عمر نصف يبلغ أيام أو أسابيع. تتضمن المرحلة الأولية من التوزيع بالضرورة ارتباط ASO بالبروتينات وتوزيع هذه المجمعات على أنسجة الكبد والكلى والعقد الليمفاوية ونخاع العظام والطحال ، والتي تعد أكثر مواقع الترابط والتراكم نشاطًا لـ ASO . من الواضح أن مرحلة التخلص من ASO بسبب الارتباط الأولي بالبروتين يتم تحديدها من خلال المرحلة الأولية من توزيعها. بسبب التشبع المحتمل للبروتينات , تزداد المنطقة الواقعة تحت منحنى الحرائك الدوائية (AUC) مع زيادة الجرعة ، لأن ASO لم يعد يرتبط بالبروتينات بعد تشبعها ، ولكنه يدخل مجرى الدم بشكل حر. بعد الارتباط ، يدخل ASO الخلايا على طول تدرج تركيز من الفضاء خارج الخلية عبر غشاء الخلية إلى الفضاء داخل الخلايا ، ربما بمساعدة بروتين ناقل. ترتبط ASOs في الخلايا بالأهداف المتاحة ، ولكن بشكل أساسي ASOs في الخلايا على الأرجح ترتبط بالبروتينات داخل الخلايا. في الخلية ، تعمل نوكليازات في كل مكان ، ولكن ليس إنزيمات السيتوكروم P450 ، على استقلاب مستحضرات ASO. نظرًا لأن إنزيمات السيتوكروم P450 تقوم عادةً باستقلاب الأدوية الجزيئية الصغيرة ، فإن ASOs لا تتنافس في عمليات التمثيل الغذائي مع مركبات الجزيئات الصغيرة التقليدية ، مما يقلل من مخاطر التفاعلات الدوائية. إن إفراز ASO في البول هو في النهاية نتيجة التمثيل الغذائي في الأنسجة وإنشاء توازن للأيضات والمواد الأصلية خارج الأنسجة وفي الدورة الدموية الجهازية. هذه العمليات في حيوانات المختبر والبشر متشابهة جدًا ، ولهذا السبب لا يمكن تحديد علاقة بين الأنواع بين حيوانات المختبر والبشر.

حاليًا ، يتم استخدام تكوين ASO من "الجيل الثاني" ، والذي يتميز بمجموعات MOE في 2 "موقع من النيوكليوتيدات عند النهايتين 3 و 5" ، على نطاق واسع في التجارب السريرية. هذا التكوين هو هيكل أكثر تقدمًا مقارنةً بشبكات ODN الفوسفاتية غير المعدلة . ، وهي أدوية من الجيل الأول مضادة للحساسية ، ويرجع ذلك إلى فعاليتها المتزايدة وتقليل السمية وزيادة عمر النصف. ترتبط العديد من العوامل المرتبطة بالانتقال من الجيل الأول إلى الجيل الثاني من ASO ارتباطًا مباشرًا بتحسين حركتها الدوائية.

ملامح التركيب الكيميائي لـ ASO

هيكل عظمي فوسفوثيوات

ارتبطت المحاولات الأولى لإنشاء عقاقير ذات نشاط مضاد للدلالة باستخدام الحمض النووي غير المعدل ، والذي ، للأسف ، كان شديد التأثر بالتحلل بواسطة نوكلياز. كما اتضح ، تشق نوكليازات في كل مكان روابط فسفودايستريز للحمض النووي الأصلي ، مما يؤدي إلى أن نصف عمر ASO غير المعدّل هو دقائق. كان هذا التدهور السريع سمة رئيسية لملف الحرائك الدوائية للحمض النووي غير المعدل. أدى تغيير العمود الفقري للفوسفودايستر من الحمض النووي إلى الفوسفوثيوات إلى تغيير ملف الحرائك الدوائية لـ ASO بشكل جذري. في هذه المستحضرات ، تستبدل بنية الفوسفاتيوت ذرة كبريت واحدة في روابط الفوسفوديستر بذرة أكسجين واحدة غير جسر. يزيد هذا الهيكل من مقاومة ASO للنوكلييز ، ونتيجة لذلك ، يحسن خصائصها الحركية.

شرالية الفوسفوثيوات

أظهرت الدراسات أن ثيكون الهيكل العظمي ACO لا يزيد فقط من مقاومته للنوكلييز ، بل يساهم أيضًا في ظهور chirality ، أي إمكانية وجود الأيزومرات الفراغية ، في كل رابطة فوسفورية ، مما يؤدي إلى حقيقة أن في أي 20 مير ACO يوجد 219 Sp أو Rp ستيريو. يؤثر الجمع بين مقاومة نوكلياز وزيادة ارتباط البروتين بشدة على الحرائك الدوائية لـ ASO. تؤدي زيادة ثبات ASO إلى حقيقة أن نصف عمر الدواء من البلازما يزيد إلى 30-60 دقيقة مقارنة بعمر نصف فوسفوديستر ASO ، وهو 1-2 دقيقة.

إن مقاومة نوكلياز و chirality الناتجة عن استبدال الفوسفوديستر بروابط الفوسفوثيوات تستحق المناقشة لأن الخصائص الفيزيائية المرتبطة بهذه الميزة الهيكلية مهمة لكل من ASOs من الجيل الأول والثاني. تنشأ مقاومة نوكليازات ASO الفوسفاتية بسبب قرب الكبريت من الأكسجين غير المتصل في الموقع النشط للنوكلياز الخارجي إلى أيون المعدن. يمكن أن يتسبب هذا القرب في إزاحة أيون المعدن من الموقع النشط. تم توضيح هذا التأثير في نموذج 3'-5 'DNA polymerase exonuclease. تدعم بيانات التصوير البلوري بالأشعة السينية هذه الفرضية حول إزاحة أيون المعدن. تتوافق الاختلافات الواضحة في حساسية الأيزومرات الفراغية إلى نشاط نوكلياز خارجي لبوليميراز الحمض النووي مع التشكل المقترح لإيزومرات فوسفورية فوسفاتية ODN في الموقع النشط. من المحتمل أن تداخل روابط الفوسفوروثيوات قد تتداخل مع نوكليازات أخرى بنفس الطريقة ، أي عن طريق إزاحة أيون معدني ، على الرغم من أن نوكليازات خارجية مختلفة قد تُظهر تفضيلات مختلفة لروابط Rp و Sp اعتمادًا على طبيعة الموقع النشط للإنزيم.

بدلاً من ذلك ، يمكن للكبريت ببساطة أن يحل محل الأكسجين في روابط الديستر. الاختلافات في قدرة الكبريت على تحمل شحنة سالبة ، مقارنة بالأكسجين ، تجعل من الممكن التنبؤ بالتغيرات في الموقع النشط. من المرجح أن يكون هذا التغيير بسبب التحلل المائي لروابط الفوسفوديستر ، وقد يكون من خلال تكوين فوسفور عابر خماسي التكافؤ مع ذرتين من الأكسجين سالب الشحنة. إن استبدال إحدى ذرات الأكسجين الاستوائية بالكبريت سيكون له آثار سلبية على نشاط الإنزيم: (1) يتم تقليل ارتباط الماء ، مما يؤدي إلى استقرار الشحنة السالبة المحلية على الذرات ، مما يجعل من الصعب الحصول على شحنة سالبة ثانية على الكبريت ؛ و (2) تقليل ارتباط المغنيسيوم 2+ بالكبريت. هناك دليل على التأثير الأخير في الدراسات التي أجريت على مستوى انقسام الريبوزيم لإدراج فوسفوروثيوات دياستيريومير ، عندما تؤدي إضافة Mg 2+ إلى تثبيط تأثيرات انشقاق ريبوزيمات الفسفوروثيوات. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن هناك بعض الانخفاض في نشاط نوكلياز في مناطق الهيكل العظمي بعيدًا عن روابط الفوسفوثيوات ، مما يشير إلى انتقال التأثير chirality. يمكن تفسير هذه الظاهرة بشكل أفضل من خلال التغييرات في ترتيب جزيئات الماء حول العمود الفقري للفوسفوثيونات مقارنةً بالعمود الفقري للفوسفودايستر.

تؤثر التأثيرات النوعية على نشاط نوكلياز بشكل كبير على الحرائك الدوائية لـ ASOs الفوسفوروثيوات ، ويتجلى هذا بشكل واضح في معدل التمثيل الغذائي للجيل الأول من ASOs الفسفوروثيوات في بلازما الدم. ينخفض ​​معدل الإزالة الكاملة لـ ASO من البلازما ، مما يشير إلى تباطؤ عملية التمثيل الغذائي. لا يمكن تفسير هذه التغييرات في المعدل من حيث حركية الدرجة الأولى وحدها ، ولكن يمكن تفسيرها بالاختلافات في قابلية تأثر سندات Rp و Sp.

الاختلافات النوعية في نشاط نوكلياز خارجي أقل أهمية بالنسبة للجيل الثاني من ASOs. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ASOs من الجيل الثاني لديها 2 "- تعديلات في نهايات 3" - و 5 "، مما يمنع انشقاقها بواسطة نوكلياز خارجي. بمساعدة نوكلياز داخلي معزول عن العامل الممرض Serratia marcescens ، فإن التأثيرات تمت دراسة تزاوج روابط الفوسفوروثيوات. وبنفس طريقة نوكليازات خارجية ، فهو أحد الأكسجين غير الجسور للتحلل المائي لسندات الفسفودايستر. التي ينقص نشاط الإنزيم منها ، بينما في diastereomer Rp لا يحدث ذلك. نظرًا لأن نوكلياز Serratia له أوجه تشابه كبيرة مع بعض نوكليازات الثدييات ، ينبغي افتراض أن هذه الآلية يمكن تطبيقها على نطاق واسع. لا يُعرف عمل نوكليازات داخلية أخرى ، ومع ذلك ، إذا افترضنا أن التفاعل يستمر وفقًا لمخطط مشابه لـ Serratia endonuclease ، فيمكننا افتراض أن الموقع النشط سيحتوي و إنه معدن (ربما Mg 2+) وسيؤثر الكبريت على عمل نوكليازات , عندما يتم توجيهه إلى أيون المعدن. إذا كانت نوكليازات داخلية حساسة للشرولية ، فقد يكون لذلك آثار مهمة على تطوير مشكلة إنشاء أدوية الجيل الثاني الفعالة. بالإضافة إلى تأثير chirality على أدوية الجيل الأول ، يمكن أن يؤدي التأثير اللولبي على التمثيل الغذائي لأدوية الجيل الثاني إلى تباطؤ عملية التمثيل الغذائي. وهكذا ، على سبيل المثال ، يمكن افتراض أن الأيزومرات الفراغية سريعة التمثيل الغذائي سوف يتم تدميرها بشكل انتقائي ، مما يترك فقط الأيزومرات التي يتم استقلابها ببطء.

ASO يرتبط بالبروتينات

وقد وجد أنه ، بالمقارنة مع ASO مع الهيكل العظمي الفسفوريستر ، تتأثر الحرائك الدوائية لهياكل الفوسفوثيوات بشكل كبير من خلال ارتباطها بالبروتينات. الأساس الكيميائي لزيادة الارتباط بالبروتين هو زيادة ألفة روابط الفوسفاتيونات بالدهون مقارنة بروابط الفوسفوديستر. نظرًا لأن التفاعلات الجزيئية مع الماء يتم تحديدها من خلال شكل ووظيفة الجزيئات الكبيرة في محلول مائي ، فحتى التغييرات الطفيفة في محبة الدهون الهيكلية على طول طول ASO يمكن أن يكون لها عواقب على تفاعل قليل القسيمات مع الماء والجزيئات الكبيرة مثل البروتينات.

لتقريب أول ، ترتبط ODNs الفوسفوتية بالبروتينات الخلوية بشكل عشوائي أكثر من ODNs phosphodiester. لم يتم فهم سبب ارتباط ASOs الفوسفوثيوات بشكل أفضل بالبروتينات بشكل كامل. تشير التفسيرات المحتملة إلى زيادة التعرق للدهون والتعقيد مع أيونات المعادن.

لا يمكن المبالغة في تقدير أهمية ارتباط بروتين البلازما للصيدلة ، والحرائك الدوائية ، وعلم السموم من ASOs الفوسفاتية (كلا الجيلين الأول والثاني). على مستوى التركيز الميكرومولاري ، ترتبط أكثر من 90٪ من ODNs الفوسفوتية بالبلازما. هناك اختلافات محددة في النسبة المئوية وقوة ارتباط البروتين ، فضلاً عن الاختلافات النوعية في ارتباط ASO ببروتينات معينة في أنواع مختلفة. إن ارتباط ASOs الفوسفوثيوات بالبروتينات المنتشرة يحافظ على هذه المركبات من الترشيح بواسطة الكبيبات الكلوية وإفرازها في البول. في حالة التشبع ، على سبيل المثال ، عند إعطاء جرعة كبيرة من ASO ، يتم تحسين إفراز البول من ASO كامل الطول. نظرًا لاختلافات الأنواع ، يتم تحديد التشبع في الأنواع المختلفة من خلال تركيزات مختلفة من ASO. على سبيل المثال ، بروتينات بلازما الفأر لها ألفة أقل لـ ASO من تلك الموجودة في الجرذان أو البشر. لذلك ، يحدث تأثير تشبع عملية ارتباط ASO ببروتينات البلازما في الفئران بتركيزات أقل مقارنة بالأنواع الأخرى. تعتبر الاختلافات بين الأنواع في ارتباط بروتين البلازما عاملاً مهمًا في الاختلافات في الحرائك الدوائية بين الأنواع.

مقاومة النيوكليز وربط البروتين ، وهما من سمات ASO مع روابط الفوسفوثيوات ، يغيران أيضًا الحرائك الدوائية للعلاج ASO. تُحدث التركيبات الكيميائية الإضافية ، المميزة للجيل الثاني من الأدوية المُبتكرة ، تغييرات أخرى في حركتها الدوائية.

مشتقات ميثوكسي إيثيل من ACO

تم تطوير الجيل الثاني من ASOs لتحسين بعض خصائص الجيل الأول من ODN. وهكذا ، فإن تراكيب الفوسفوثيونات المضافة إلى مجموعات MOE في المواضع 2 "تزيد من مقاومتها للنوكلييز وتغير كفاءة الارتباط بالبروتين.

مقاومة MOE للنوكليازات

لقد تبين أن هيكل MOE يؤثر على مقاومة ASO للنوكليازات. بينما تقلل هياكل الفوسفوثيونات من نشاط نوكلياز خارجي ، فإن الهيكل الموجود في الموضع 2 "يزيل فعليًا نشاط نوكلياز خارجي. قد تكون مقاومة نوكلياز نتيجة (1) استبدال الهيدروجين 2 بوصات لـ MOE ، أو (2) تأثيرات ستريكية لل MOE ، أو (3) تشكيل غلاف مائي صلب حول هيكل ASO. مهما كانت أسباب مقاومة نوكليازات ، فإن وجود مجموعة MOE يجعل ASOs يتغير في الوضع 2 "محصنًا عمليًا من تأثيرات الدورة الدموية ومعظم نوكليازات الخلايا. المنطقة الوسطى من الهيكل العظمي ASO ، التي تتكون من deoxyphosphothioates ، ليست تقريبًا مثل مقاومة الانقسامات بوساطة نوكلياز.الاختلافات في ASO للجيلين الأول والثاني في المواقع المعرضة لعملية التمثيل الغذائي ، كما تحدد الاختلافات في أنماط التمثيل الغذائي.

عند تقييم الأنماط الأيضية باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الشعري (CGE) أو اللوني السائل / مقياس الطيف الكتلي (LC / MS) ، لم يتم العثور على مستقلبات كانت أقصر بواسطة نيوكليوتيد واحد. الأهم من ذلك كله ، تم العثور على المستقلبات المشقوقة في موقع الديوكسي (على الأرجح عن طريق نوكليازات داخلية) ، والمسار الآخر لعملية التمثيل الغذائي هو تقليل حجم منتجات الانقسام. تؤدي مقاومة نوكلياز خارجية وبطء عملية التمثيل الغذائي تحت تأثير نوكليازات داخلية نشطة إلى تكوين مركبات تتميز بنصف عمر طويل .

ربط MOE بالبروتينات

أظهرت الدراسات التجريبية أن ASOs الفوسفوتية مع هياكل 2'-MOE لديها تقارب أقل لبروتينات البلازما مقارنة مع ASOs غير المعدلة من الفوسفوثيونات. حوالي 18 إلى حوالي 40 ميكرومتر. في الوقت نفسه ، في بنية MOE المستبدلة بالكامل لـ ASO ، ينخفض ​​تقارب بروتينات البلازما بشكل طفيف فقط. لماذا لا تؤثر الزيادة في عدد هياكل MOE في قليل النوكليوتيد على مزيد من الانخفاض في تقارب بروتينات البلازما ، ولكن هذا قد يكون بسبب ميزات البنية الثانوية ASO.

يمكن تبرير الانخفاض في تقارب البروتين المرتبط بهياكل MOE من خلال بعض الخصائص الفيزيائية. ربما يكون العامل الفيزيائي الأكثر أهمية الذي يميز ASOs المعدلة من MOE عن غير المعدلة هو وجود غلاف جزيئي مائي ، والذي ينشأ من سلسلة جانبية MOE. بدائل MOE في جزيئات الماء "المخلبة" التي تشكل العمود الفقري للهيدروكربون (وربما أيونات معدنية) ، وتشكل غلافًا مائيًا ، وتقليل التلامس المحتمل بين جزيئات الكبريت "اللاصقة" والبلازما أو البروتينات الخلوية. ترتبط درجة ارتباط ASO بالبروتينات عكسيًا بإفرازها في البول. يؤدي إدخال روابط الفوسفوثيونات وبدائل 2'-MOE إلى تغيير ارتباط البروتين ، ونتيجة لذلك ، يغير خصائص ASO.

الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي وإفراز ASO

مص

طريق الحقن لإدارة ASO

أثبتت الدراسات أنه نظرًا للوزن الجزيئي (حوالي 7000 D) والشحنات السالبة لـ ASO ، فإن امتصاص هذه الأدوية من الجهاز الهضمي محدود. هذا هو السبب في أن الطريق بالحقن لإدارتها عادة ما تستخدم. يتم استخدام الحقن تحت الجلد أو في الوريد أو الحقن داخل الجسم الزجاجي لإدارة أدوية الجيل الأول. انخفاض النشاط المؤيد للالتهابات للجيل الثاني ASOs يجعلها أكثر ملاءمة للإدارة تحت الجلد. الحرائك الدوائية لهذه الأدوية في البلازما مع الحقن تحت الجلد والحقن في الوريد قابلة للمقارنة. تظهر الدراسات التي أجريت على حيوانات المختبر أنه في النهاية ، يمكن مقارنة توزيع ASO عبر أعضاء مختلفة ، باستثناء موقع الحقن والعقد الليمفاوية.

بعد الإعطاء تحت الجلد ، يتم امتصاص ASOs من الجيلين الأول والثاني بسرعة من موقع الحقن إلى الدوران الجهازي. في الدراسات السريرية ، بعد تناول الجيل الثاني من ASO تحت الجلد ، يتراوح الوقت اللازم للوصول إلى أقصى تركيز (T max) من 1.5 إلى 4.7 ساعة في نطاق الجرعة من 25 إلى 200 مجم بحجم ثابت 1 مل. يتراوح التوافر البيولوجي للجرعة تحت الجلد من 36 إلى 82٪ من الجرعة المعطاة. تشير الدراسات قبل السريرية والسريرية إلى أن التوافر البيولوجي لـ ASO يزداد مع التركيز.

يمكن أن تؤثر حركية ASOs في موقع الحقن على الاستجابة المحلية بالإضافة إلى الحركية النظامية وتوزيعها. يقلل تقليل تركيز ASO في موقع الحقن افتراضيًا من الاستجابة الموضعية للحقن. تتمثل إحدى الطرق لتقليل تركيز ASO في موقع الحقن في تخفيف المحلول ، ونتيجة لذلك ، زيادة مساحة الامتصاص من المستودع تحت الجلد. نظريًا ، يجب أن يؤدي تخفيف المحاليل ومساحة سطح الشفط الكبيرة إلى تقليل التركيز الموضعي وتقليل التفاعلات المحلية. يمكن توقع نفس التأثيرات مع زيادة الامتصاص الجهازي. لذلك ، يمكن اعتبار التغييرات في الجرعة والحجم من المتغيرات المحتملة. ومع ذلك ، حتى اليوم ، تُظهر الحقن تحت الجلد بكميات منخفضة وتركيزات عالية نسبيًا التوافر البيولوجي العالي للمادة المطبقة.

الإدارة المحلية لـ ASO

توضح دراسة الطرق المختلفة لإدارة ASO أن أشكال الهباء الجوي ، وإعطاء المستقيم والحقن داخل الجسم الزجاجي تستخدم كوسيلة للإدارة المحلية. لعلاج أمراض الرئة ، من الممكن إنشاء تركيزات عالية نسبيًا من ASO في الرئتين باستخدام الهباء الجوي.

تمت دراسة حركية الجيل الأول من ODN في الفئران. لقد ثبت أن حركية هذه الأدوية تعتمد على الجرعة ، والتصفية الرئوية مع عمر نصف يبلغ حوالي ساعتين. في المقابل ، تُظهر الدراسات التي أجريت على ASOs من الجيل الثاني المعدلة MOE نصف عمر لأكثر من 4 أيام. كما هو الحال مع العلاجات الموضعية الأخرى ، تتمثل ميزة الاستنشاق في القدرة على تكوين تركيزات محلية عالية في الأنسجة التي لا تتراكم عادة المواد المطبقة. في الرئتين ، لا يتراكم ASO عادةً بعد الإعطاء بالحقن. نادرا ما تسبب الإدارة المحلية تأثيرات جهازية. على سبيل المثال ، عندما تم إعطاء ASO للقرود بجرعة 0.1 مجم / كجم عن طريق الاستنشاق (ثلاث جرعات على مدى أسبوع واحد) ، كان تركيز الدواء في الرئتين حوالي 1 ميكروغرام / غرام. ولكن في نفس هذه القرود ، كان التركيز في الكبد والكلى يقارب 5٪ من التركيز في الرئتين ، مما يشير إلى تأثير جهاز أصغر بكثير.

تشير بيانات الأدبيات إلى أن الإعطاء المستقيمي لـ ASO يستخدم بنجاح لعلاج التهاب القولون التقرحي. على عكس الاستنشاق ، حيث يمكن استخدام كميات صغيرة من المادة المحقونة ، يمكن أن تحتوي الحقنة الشرجية المستخدمة في العلاج على ما يصل إلى 240 مجم من مادة (alicaforsen) من الجيل الأول. في هذه الحالة ، تتعرض ظهارة المستقيم للمادة المحقونة ، ومع ذلك ، نظرًا لضعف نفاذية ODNs المشحونة بشدة ، هناك حد أدنى من امتصاص الدواء ، بالإضافة إلى تأثير جهاز عام. تظهر الحسابات أن تركيز ASO في ظهارة الأمعاء بعد 12 ساعة من الإعطاء هو 20 ميكروغرام / غرام. يتراوح التوافر البيولوجي لدى البشر من 0.03 إلى 2.14٪ وأقصى تركيز لـ ASO المحدد في البلازما هو 0.126 ميكروغرام / مل فقط. إن لغياب الامتصاص الجهازي الكبير والتركيز الموضعي العالي للدواء لهما تأثير إيجابي على العلاج.

أجريت دراسة على الحقن داخل الجسم الزجاجي لمستحضرات ASO لكل من الجيلين الأول والثاني. في هذه الحالة ، يتم حقن المواد في العين بكميات صغيرة جدًا. بسبب عزل موقع الحقن ، يتم تقليل التأثيرات الجهازية للدواء إلى حد أكبر. في العين والجسم الزجاجي والشبكية ، يدخل ASO بمعدلات مختلفة: يدخل الجسم الزجاجي بشكل أسرع مقارنة بالشبكية. يساهم كل من التمثيل الغذائي المحلي والانتشار من العين في القضاء على الدواء. كما لوحظ بالفعل ، نظرًا للكميات الصغيرة ، يكون التأثير الجهازي للدواء المعطى ضئيلًا. ومع ذلك ، فإن آلية التوزيع الجهازي تشبه معظم الأدوية الأخرى.

الإدارة المعوية لـ ASO

يضمن الثبات الملحوظ للجيل الثاني من ASO للنيوكليازات استقرار الدواء في الأمعاء ، مما يجعل من الممكن زيادة الامتصاص. ومع ذلك ، فإن حجم الجزيء وشحنات ACO تحد من امتصاص الدواء. بعد الامتصاص من الأمعاء ، تكون حركية ASO مماثلة لتلك الخاصة بالإعطاء بالحقن. على الرغم من أن الكبد هو أحد المواقع الرئيسية لتراكم ASO ، إلا أن تأثير المرور الأول عبر الكبد ليس عاملاً مهمًا يؤثر على حركية عقار ASO.

توزيع ASO في الجسم

دور التروية وتقارب الأنسجة

يعتمد توزيع ASO والأدوية الأخرى على النفاذية ، وشدة إمداد الدم ، والارتباط ببروتينات البلازما والأنسجة والخلايا. لقد ثبت أن توزيع ASOs الفوسفاتي للجيل الأول والثاني في الأنسجة بشحناتها السالبة المتعددة وربطها بالبروتينات أقل اعتمادًا على إمدادات الدم ، وأكثر اعتمادًا على العوامل التي تؤثر على انتقالها إلى الخلية.

يكون التوزيع الداخلي من البلازما إلى الأنسجة سريعًا نسبيًا ، ويكون عمر النصف للتخلص من 30-90 دقيقة بعد الإعطاء في الوريد. يكون عمر النصف لـ ASO بعد الإعطاء تحت الجلد أطول منه بعد الإعطاء في الوريد. يرجع هذا الاختلاف إلى الوقت اللازم للامتصاص وليس بسبب الاختلافات الأخرى في الحرائك الدوائية.

لاحظت دراسة حركية الأدوية للجيل الأول والثاني اختلافات طفيفة. يتم تعويض المزيد من الاستقرار للجيل الثاني من نوكلياز ASO من خلال ارتباطها المنخفض بالبروتينات. إلى جانب ذلك ، فإن خصائص الحرائك الدوائية للأدوية من الجيل الأول والثاني متشابهة أو لا يمكن تمييزها تقريبًا عند مقارنة مجموع ASO الأصلي ومستقلباته (إجمالي ASO) من الجيل الأول مع الجيل الثاني السليم للعقار (ISIS 13650). خلاف ذلك ، فإن التدمير الأسرع لـ ASO بواسطة نوكليازات خارجية سيقصر من عمر النصف لأدوية الجيل الأول مقارنة بأدوية الجيل الثاني. يعتمد توزيع الأدوية لكلا الجيلين على الجرعة.

كما هو مذكور أعلاه ، بعد الامتصاص من موقع الحقن أو الأمعاء ، ترتبط ASOs ببروتينات البلازما. اثنان من بروتينات البلازما التي ترتبط على وجه التحديد بـ ASOs هما الألبومين و alpha-2-macroglobulin. بروتين شائع آخر ، وهو البروتين السكري الحمضي ، لا يرتبط بـ ASO. يعتبر ارتباط البروتين مهمًا جدًا لتوزيع ASO في الأنسجة المستهدفة. تؤدي التركيبات الكيميائية التي تقلل الارتباط إلى انخفاض ملحوظ في تركيز الدواء في الأنسجة ، وزيادة درجة ترشيحه من خلال الكبيبات الكلوية وإفرازه في البول. يمكن ملاحظة هذه الظاهرة عند استخدام ASO مع روابط diester في الهيكل العظمي للتحضير أو في وجود هيكل MOE. يسمح انخفاض تقارب diesters وهياكل MOE (أو كليهما) للبروتينات بالدوران بحرية أكبر في مجرى الدم ، مما يؤدي إلى تكثيف إفرازه في البول.

في جميع الدراسات التي أجريت على ASOs من الجيل الأول والثاني بالحقن ، لم نلاحظ إزالة خطية لـ ASOs من البلازما. انخفض التصفية مع زيادة جرعة الدواء ، وبالتالي ، كان التوافر البيولوجي له أكبر مما هو متوقع من الجرعة المعطاة. نظرًا لأن التصفية الأولية ترجع إلى توزيع ASO في الأنسجة ولوحظ امتصاص الأنسجة للدواء ، فيمكن افتراض أنها مشبعة بـ ASO. يمكن إجراء دراسة عملية التشبع نتيجة إدخال ASO باستخدام خلايا الكبد. عندما يصل ارتباط ASO بخلايا Kupffer إلى التشبع ، سيبدأ انخفاض التقارب. يؤدي الإعطاء اللاحق لـ ASO إلى الفئران إلى تحسين توزيع ASO على خلايا الكبد غير البلعمية ، ونتيجة لذلك ، تم تحسين النشاط الدوائي في خلايا الكبد مقارنةً بالسيطرة. على العكس من ذلك ، عند تركيزات البلازما أقل من 1 ميكروغرام / مل ، ترتبط ASO بشكل أكثر فعالية بخلايا كوبفر وتتراكم بشكل أقل في خلايا الكبد.

أظهرت دراسة عملية ارتباط ASO ببروتينات البلازما أن هذا التأثير مصحوب بتوزيع سريع للمركب في الأنسجة فوق سطح الخلية. على الرغم من عدم تحديد الآليات الدقيقة للربط الخلوي ، يمكن افتراض أن ASOs ترتبط ببروتينات البلازما أو البروتينات الخلوية طالما توجد مواقع ارتباط مجانية. يتم بعد ذلك توزيع ASOs المربوطة على طول تدرج التركيز عبر غشاء الخلية عن طريق تبادل بروتين خارج الخلية لبروتين داخل الخلية.

وبالتالي ، فإن القوة الدافعة لدخول ASO إلى الخلايا هي تدرج التركيز. تم وصف حركة مكوك ASO بين السيتوبلازم والنواة. بشكل عام ، من الواضح أن ارتباط البروتين يسهل حركة ACO من خلال حواجز تمنع عادة حركة الجزيئات المحبة للماء عالية الشحن. تظل آلية المكوك الغشائي فرضية لـ ASO ، ولكن تم وصفها سابقًا للمركبات المعدنية العضوية. تم تصور نقل ASO من المصفوفة خارج الخلية إلى الفضاء داخل الخلايا في كبد الفئران باستخدام طرق كيميائية مناعية وفي كلى الفئران باستخدام الفحص المجهري الحيوي مع ملصق الفلورسنت للجيل الثاني من ASO (S. Henry ، B. Molitoris).

إن هوية البروتينات التي تتحكم في نقل ASO من خارج الخلية إلى الفضاء داخل الخلية غير معروفة ، ولكن يُعتقد أن ارتباط معقد البروتين ASO بالخلية يتم باستخدام المستقبل البلعمي. نظرًا لأن الخلايا البلعمية ، مثل خلايا كوبفر وخلايا الأنسجة الضامة وخلايا الأنابيب القريبة ، لها تقارب كبير مع ASO ، يمكن للمرء التفكير في إمكانية العثور على مثل هذه المستقبلات على سطح الخلية.

ومع ذلك ، فإن التوزيع الخلوي والديناميكا الدوائية لـ ASO في الفئران المعدلة وراثيًا التي تفتقر إلى مستقبلات البلعمة SR-A I / II لم تختلف عن تلك الخاصة بالحيوانات المتحولة الضابطة. وبالتالي ، لا يبدو أن هذا المستقبل ، المعروف باسم مستقبلات Scavenger ، مسؤول عن امتصاص الكبد والكلى لهذا المركب. لم يتم دراسة دور الهياكل المستقبلة الأخرى المشاركة في عمليات الالتقام الخلوي لمركب البروتين ACO.

بروتينات الغشاء التي تعمل كناقلات , موجودة في جميع الكائنات الحية. ناقلات الأدوية الرئيسية هي: ABC ( ناقلات شرائط ربط ATP)و SLC (عائلة الناقل المذاب). من المعروف أن معدل نقل المواد عبر الأغشية البيولوجية باستخدام عمليات بوساطة ناقلات يتميز بالتشبع. تم وصف العديد من أعضاء عائلة SLC ذات السمات المعروفة , بشكل أساسي لنقل النيوكليوسيدات والسكريات النيوكليوزيدية والسكريات الفوسفاتية. هناك رأي مفاده أن الدراسات المستقبلية ستعنى على الأرجح بعمليات النقل بين الغشاء ASO.

من الواضح أنه بالإضافة إلى الاختلافات المذكورة أعلاه في تراكم الهياكل التي تم إنشاؤها بواسطة أعضاء وأنسجة مختلفة واعتماد تصفية وتوزيع هذه المركبات على جرعاتها ، فإن توزيع ASO في الأنسجة يتأثر بأنظمة النقل ، خصائص تدفق الدم للأفراد ، ووقت الإقامة المحتمل للدواء في الجسم ، وأخيراً تشبع الأنسجة بـ ASO. على الرغم من الدور الهام لهذه العوامل في عمليات توزيع أنسجة ASO ، يُعتقد أن الارتباط الأولي لـ ASO بسطح الخلية هو أحد العوامل المحددة في الآليات التي تم تحليلها. يعتمد هذا الاستنتاج على حقيقة أن الكبد والكلى هما الموقعان الأوليان لارتباط ASO مع بعض التراكم الإضافي في الـ 24 ساعة الأولى بعد إعطاء ASO. عند دراسة معلمات توزيع ASO في الكبد والكلى ، ظهرت زيادة جزئية في تركيز الدواء في الأعضاء خلال الـ 24 ساعة الأولى. يحدث هذا خلال فترة إعادة التوزيع الخلوي وشبه الخلوي لـ ASO ، ولكن من المفترض أن تتراكم أجهزة التوزيع الأولية المزيد من المواد بمرور الوقت بسبب التقارب الأكبر لهذه الأعضاء مع ASO. قد تحتوي البروتينات المسؤولة عن هذا التقارب على مواقع ارتباط شبيهة بالهيبارين للامينين والفيبرينوجين وعامل نمو الأرومة الليفية (FGF). قد يكون التفاعل المبكر لـ ASO مع الخلية ناتجًا عن ارتباط هذه البروتينات ، ولكن طبيعة هذه البروتينات ، كما هو مذكور أعلاه ، لم يتم دراستها كثيرًا.

بالنظر إلى أهمية الجمع بين مواقع ارتباط ASO المحددة مع الخلايا في توزيع الدواء في الجسم ، ينبغي للمرء أيضًا أن يلاحظ عاملًا مهمًا مثل إمداد الدم بأعضاء مختلفة ، وإمكانية التأثير على التوزيع المختلف للفوسفوثيوات ASO واضح. وفقًا لمؤلفين مختلفين ، فإن العمل مع عشرات سلاسل المواد لكل من الجيلين الأول والثاني يشير إلى توزيعها المماثل ، وتوزيعًا مشابهًا بشكل ملحوظ في الأفراد من الأنواع المختلفة. الكلى والكبد والعقد الليمفاوية والطحال ونخاع العظام هي الأعضاء التي تتراكم فيها أكبر كمية من ASO ومستقلباتها. تشير حقيقة أن الرئتين والقلب لا يتراكمان ASO إلى أن التراكم الواضح لـ ASO في الكبد والكلى لا يكفي لتفسير إمدادات الدم الجيدة وحدها. على سبيل المثال ، المناطق ذات الدورة الدموية الأفضل في الكلى هي الكبيبات ، وهي ليست المناطق التي تحتوي على المزيد من ASO. على العكس من ذلك ، في الأنابيب القريبة ، تكون الدورة الدموية أقل نشاطًا. ومع ذلك ، تتميز خلايا الأنابيب القريبة بعدد كبير من الخلايا البلعمية النشطة ، والتي تتراكم ASOs الحرة ، وكذلك ASOs المرتبطة بالبروتينات التي عادة ما يتم امتصاصها في الأنابيب القريبة. نتيجة لذلك ، تحتوي القشرة الكلوية والظهارة الأنبوبية القريبة على أعلى تركيز من ASOs الفوسفوتية ، من الجيلين الأول والثاني.

وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن إمداد الدم (مل / غ أنسجة) للكبد يبلغ حوالي 20٪ من إمداد الكلى. 4-5 أضعاف الاختلافات في التروية بين الكلى والكبد لا تؤدي إلى اختلافات 4-5 أضعاف في تركيز ASO في هذه الأعضاء. تزيد الشعيرات الدموية المنفذة من منطقة التلامس بين ASO ومجرى الدم ، وبالتالي ، يمكن أن يعوض ذلك عن عدم كفاية نضح الكبد بالنسبة للكلى.

ASO يرتبط ببروتينات البلازما أثناء التوزيع

على الرغم من أن تشبع الخلايا بـ ASO يؤثر في النهاية على توزيعها في الأعضاء ، فإن ارتباط ASO ببروتينات البلازما يمكن أن يغير التوزيع في الكلى والكبد في سلاسل مختلفة. هناك اختلافات متسلسلة في ارتباط البروتين. مع انخفاض ارتباط ASO ببروتينات البلازما ، يقل تراكمها في الكبد ويزداد تراكمها في الكلى. على العكس من ذلك ، مع الارتباط العالي ، سيكون تركيز ASO في الشكل الحر في مجرى الدم بكميات أقل ، ويتراكم أقل في الكلى وأكثر في الأعضاء الأخرى. توجد علاقة عكسية بين درجة ارتباط ASO بالبروتين وتراكمها في كليتي الجرذان والقرود بعد الإعطاء المتكرر عن طريق الوريد وتحت الجلد.

يمكن استخدام ارتباط البروتين كمعيار اختيار لـ ASO للتجارب السريرية. حتى الآن ، يعد تحديد ارتباط البروتين عملية تجريبية بدون طريقة للتنبؤ بالسلسلة التي سترتبط أكثر أو أقل بالبروتينات.

توزيع ASO على الأجهزة الأخرى

بغض النظر عن تسلسل توزيع ASOs الفوسفوثيوت للجيل الأول والثاني ، لوحظ نمط مميز لتوطين هذه الأدوية في الكلى والكبد ، وكذلك في الطحال والغدد الليمفاوية والعظام وفي سيتوبلازم الخلايا الدهنية. يمكن تفسير تراكم ASO في الأنسجة اللمفاوية جزئيًا من خلال النشاط البلعمي للخلايا النسيجية والخلايا أحادية النواة الأخرى. من الممكن تصور ASO في بلعم المنسجات وأنسجة البلاعم باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين. لقد ثبت أن ASOs تخضع لعملية الالتقام الخلوي ، ويتم توطينها في الإندوسومات ، وتبقى داخل هذه الهياكل. غالبًا ما يكون تركيز ASO في الجسيمات البلعمية بحيث يمكن تحديده عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين (تقريبًا مثل الحمض النووي النووي). من المحتمل أن يشكل ASO في البلعمة غالبية ASO المتراكمة في الطحال والأعضاء اللمفاوية. بالإضافة إلى ذلك ، تتراكم خلايا العظام ونخاع العظام النشطة بالبلعمة ASO في هذه الأنسجة ، وهو ما يؤكده وجود حبيبات قاعدية في خلاياها.

لا تحتوي العضلات (الهيكلية والقلبية) على كميات كبيرة من ASO. ومع ذلك ، فإن الفحص الدقيق للعضلات باستخدام أساليب الكيمياء المناعية أو التصوير الشعاعي الذاتي يكشف عن محتوى ASO في بلعم الحلقات الضامة في سدى العضلات ، وقد يؤثر هذا التراكم جزئيًا على قياس تركيز ASO في العضلات والقلب.

يعتبر تراكم ASO في سيتوبلازم الخلايا الشحمية أمرًا مهمًا من وجهة نظر علاجية. خاصةً لأنه ، على عكس معظم المواد المتراكمة في الخلايا الشحمية ، فإن ASOs محبة للماء. تُظهر الطرق الكيميائية الهيستولوجية المناعية بوضوح أن ASO موجود في الجزء السيتوبلازمي من الخلايا الشحمية ، بينما ASO غائب تقريبًا في فجوة الدهون. تشير شدة التلوين إلى تراكم كبير للمادة في السيتوبلازم. على سبيل المثال ، في القردة بعد 13 أسبوعًا من العلاج بـ ISIS 113715 بجرعة 10 مجم / كجم / أسبوع ، كان التركيز في الكبد 301 ± 88.1 ميكروغرام / جم ، ولكن فقط 37.3 ± 14.4 ميكروغرام / غرام في الأنسجة الدهنية في نفس الحيوانات.

مع الأخذ في الاعتبار أن المكون الخالي من الدهون يمثل 10٪ من إجمالي كتلة الدهون ، فإن تصحيح تركيز ASO ، مع الأخذ في الاعتبار هذا المؤشر ، يشير إلى إمكانية مقارنة تركيزه بالتركيز الموجود في الكبد. تشير تركيزات ASO الكبيرة في الخلايا الشحمية إلى أنه يمكن استخدامها لعلاج الأمراض الوراثية لهذا النوع من الخلايا: مصادر الهرمونات والسيتوكينات. وبالتالي ، فقد وجد أن التركيزات النشطة دوائيًا من ASO مسجلة في الخلايا الدهنية للفئران عندما يتم إعطاء ISIS 113715 بجرعة 25 مجم / كجم مرتين في الأسبوع وتقليل التعبير عن الجين المستهدف PTP-1B في كل من الكبد وفي الكبد. الخلايا الدهنية. تم إجراء ملاحظات مماثلة في القرود التي عولجت بـ ASO ISIS 113715. نظرًا لأنه يمكن إجراء خزعة الدهون تحت الجلد سريريًا وبما أن ASO النشط يتراكم في الدهون ، يمكن استخدام الدهون لأخذ الخزعة وقياس التأثيرات الدوائية مباشرة (تقليل mRNA) وتركيز الأنسجة للدواء في الأنسجة البشرية.

كما يتم توزيع ASOs الفوسفوثيوات على الأنسجة الأخرى. تظهر الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية أن الخلايا البطانية تتراكم ASO بتركيزات كافية لتقليل مستويات الرنا المرسال ، مما يجعلها هدفًا محتملاً للتدخل الدوائي. في بعض الأنسجة ، لا تكون تركيزاتها عالية بما يكفي للتأثير الدوائي. على سبيل المثال ، لا تتراكم الخلايا الليمفاوية الناضجة ASO ، ويقتصر نشاط مضادات المعنى على الخلايا التائية.

يمكن أن تتراكم خلايا العظام ، وخاصة بانيات العظم النشطة بالبلعمة ، ASO ويمكن استخدام هذا التأثير لأغراض علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، تتراكم خلايا جزيرة البنكرياس أيضًا ASO. كلا من الجيل الأول والثاني من ASOs عبارة عن جزيئات محبة للماء عالية الشحن لا تعبر حواجز الدم في الدماغ أو الدم - الخصية. ومع ذلك ، كما هو الحال في العضلات ، فإن الضامة التي تحتوي على ASOs يمكن اكتشافها موضعية في المنطقة الخلالية من الخصيتين. لا يتم فصل المبيضين بواسطة حاجز ، لذلك يمكن قياس ASO كميًا في المبايض وتصور بواسطة الكيمياء المناعية في السدى.

إن التوزيع المحدود لـ ASO في البلازما على خلايا الدماغ وخلايا عضلة القلب يجعل هذه الأنسجة غير مرجحة للتدخل المضاد للتأثير ، على الرغم من أن التثبيط الانتقائي أو التعبير عن بعض بروتينات القنوات الأيونية في الدماغ والعضلات قد يكون مفيدًا علاجيًا. ومع ذلك ، يمكن اعتبار التوزيع المحدود لـ ASO في هذه الأنسجة ميزة. يقلل عدم وجود تركيزات كبيرة من ASO في الدماغ والقلب من خطر تلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويقلل من مظاهر الآثار القلبية غير المرغوب فيها. كما ذكرنا سابقًا ، يؤدي الإعطاء المباشر لهياكل الجهاز العصبي المركزي ، ولا سيما الدماغ ، عن طريق التسريب أو الحقن داخل القراب أو داخل البطينات إلى توزيع ASO داخل الجهاز العصبي المركزي وقد يكون مفيدًا علاجيًا.

أثناء الحمل ، يكون الجنين محميًا جيدًا من تأثيرات الأدوية المضادة للحساسية. لم تكشف دراسة حركية المشيمة لـ ASO عن تراكمها في الجنين ؛ لوحظ انخفاض مستوى ASO في القوارض في المشيمة. تم تكرار هذه النتائج باستمرار في دراسة المسخية لمختلف ASOs من الجيل الثاني في الفئران والجرذان والأرانب. المشيمة ، على الرغم من كونها شديدة التروية ، ليست عضوًا به تراكم عالٍ من ASO.

بشكل عام ، تُظهر الحقائق المقدمة أن توزيع ASO هو أحد العوامل الرئيسية التي تحدد شدة نشاط ASO. يبدو أن الاختلافات في توزيع ASO مرتبطة إلى حد كبير بتورم الأنسجة لهذه الأدوية وبدرجة أقل بالتروية.

التمثيل الغذائي

يتم استقلاب الأدوية المضادة للحساسية من الجيل الأول والثاني بواسطة نوكليازات ، وليس بواسطة أنظمة أوكسيديز من نوع السيتوكروم P450 ، والتي تُستخدم لاستقلاب الأدوية التقليدية للجزيئات الصغيرة المحبة للدهون. ASO ليس ركيزة لإنزيمات السيتوكروم P450 ، كما أنه لا يحث أو يثبط نشاطه بتركيزات مهمة سريريًا. يعد الانقسام الذي يتوسطه نوكلياز خارجي لـ ASO ، وهو المسار الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي والتخلص من الجيل الأول من ODNs الفوسفوثيونات ، ثانويًا للجيل الثاني من ASO. نشاط نوكلياز خارجي مقيد بجزئين: أحدهما MOE في الطرف 3 وآخر MOE في النهاية 5.

الإنزيمات المسؤولة عن استقلاب ASO

إنزيمات معينة تستقلب الجيل الثاني من ASO غير معروفة. النيوكليازات موجودة في كل مكان ويمكن الكشف عن نواتج الأيض ASO المتدهورة في معظم الأنسجة. المتجانسات الكبدية والكلى قادرة على استقلاب ASO من الجيل الثاني في المختبر دون إضافة مصادر طاقة خارجية مثل نيكوتيناميد فوسفات الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADPH) أو الأدينوزين 5 ثلاثي الفوسفات (ATP). ينتج عن الانقسام الأولي منتجان ، يتميز كل منهما بنهاية محمية بـ 5 "و 3" MOE. لا ترتبط هذه المستقلبات بالبروتينات وبالتالي تفرز من الأنسجة. نظرًا لأنه يتم إزالة المستقلبات بشكل أسرع مما تتشكل ، فلا يوجد عمليًا تراكم للأيضات في الأنسجة. وبالتالي ، لا يمكن استخدام تحديد كمية المستقلبات في الأنسجة كمؤشر على استقلاب ASO في الأنسجة.

نظرًا لأن معدل التخلص من ASO من الأنسجة يعتمد على استقلابها ، يمكن تقدير الاختلافات في التمثيل الغذائي لـ ASO في الأنسجة المختلفة بناءً على عمر النصف لهذه الأدوية من الأنسجة المميزة. بناءً على البيانات الخاصة بأربعة ASOs من الجيل الثاني ، تم استنتاج أن سلوك أعضاء هذه الفئة متشابه ، ولكن هناك اختلافات طفيفة في نصف عمرهم عن الكبد والكلى لدى القردة المعالجة بالعقار لمدة 4-13 أسبوعًا. . لقد ثبت أن عمر النصف لمستحضرات ACO ISIS 104838 و 112989 من الكبد والكلى متشابهة للغاية. تشير هذه البيانات إلى أنه بالنسبة لبعض سلاسل ASO لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في معدل التمثيل الغذائي في الأعضاء المختلفة. ومع ذلك ، فقد تم تحديد الاختلافات في عمر النصف للأنسجة في ISIS 107248 و 113715 و 301012. وتشير الاختلافات الملحوظة في معدل التمثيل الغذائي لعقاقير ASO في الكبد والكلى إلى أنه قد تكون هناك اختلافات في معدل التمثيل الغذائي في الأنسجة المختلفة ، أو أن هناك عوامل حركية أكثر تعقيدًا لبعض سلاسل المنتجات أو النتائج تعكس ببساطة عددًا صغيرًا من العينات المأخوذة خلال إطار زمني محدود.

أظهرت دراسة تفصيلية لعملية إفراز ASO من الجيل الثاني وجود معدلات مختلفة لإفرازها من أنواع مختلفة من خلايا الكبد. نظرًا لأن بعض أنواع الخلايا ، مثل الخلايا الأنبوبية القريبة من القشرة الكلوية ، تميل إلى احتواء ASO في البلعمة ، فمن المحتمل أن يفسر هذا النوع من الامتصاص الاختلافات في معدلات التمثيل الغذائي للعقاقير في الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن تتميز التسلسلات المحددة في هيكل الهيكل العظمي ASO بحساسية مختلفة للانقسام بواسطة نوكليازات داخلية.

تُظهر نوكليازات البكتيريا الخارجية درجة عالية من الخصوصية لتسلسل النيوكليوتيدات في العمود الفقري لـ ASO ، ويفترض أنها للحماية من الفيروسات. يرتبط معظم نشاط نوكليازات خلايا الثدييات بآليات النسخ وإصلاح الحمض النووي ، وبالتالي قد تختلف خصوصية أنواع الثدييات عن تلك الموجودة في نوكليازات البكتيريا الداخلية. من غير المعروف ما إذا كانت عمليات النسخ المتماثل وعمل الإنزيمات المرتبطة بظاهرة الإصلاح مسؤولة بشكل متساوٍ عن تقويض هذه ASOs الاصطناعية. في التركيزات العالية من ssDNA ، يمكن أن تتنافس ASOs بشكل فعال مع الركيزة الطبيعية. العديد من إنزيمات عائلة نوكلياز قادرة على تقويض ASO. إن تحديد الإنزيمات المحددة المشاركة في استقلاب ASO ليس أمرًا بالغ الأهمية لتطوير الأدوية المضادة للحساسية ، ولكن الفهم الأفضل لمسارات التمثيل الغذائي سيكون مفيدًا لتطوير تقنيات جديدة.

نواتج الأيض ASO

الاختلافات في التمثيل الغذائي للجيل الأول والثاني من ASOs واضحة تمامًا عند مقارنة ملف التمثيل الغذائي مع CGE. عندما يتم تحليل عينات الأنسجة أو البول في كاشف LC / MS ، تصبح طبيعة عمليات التمثيل الغذائي أكثر وضوحًا. عادة ، يتم استقلاب الجيل الأول من ODNs الفوسفوروثيوات في سلسلة من نواتج ASO ، كل منها يختلف بواسطة نيوكليوتيد واحد كنتيجة لانشقاقات النوكليوتيدات المفردة بواسطة نوكلياز خارجي. وهكذا ، بعد إدخال 20-mer ، أي تتكون من 20 نيوكليوتيد ، الجيل الأول من ODNs والبلازما والأنسجة تحتوي على عائلات من ASOs المختصرة على التوالي ، بدءًا من 19-mer وحتى ASO قصير.

الانقسام الأولي في استقلاب ASO من الجيل الثاني بوساطة
نوكليازات داخلية ، تؤدي إلى تكوين اثنين من ASO ، أحدهما مع 3 'نهاية وزارة التربية والآخر مع نهاية 5' من وزارة التربية. يمكن إجراء انقسام المنتجات ذات الأطراف غير المحمية إما بواسطة نوكلياز خارجي 5'أو 3'-نوكلياز خارجي. إن نتائج نشاط نوكلياز داخلي وخارجي مشترك هي سلسلة من منتجات الانقسام المختصرة المتسلسلة ، والتي يمكن اكتشاف العديد منها إن لم يكن كلها في البول الذي تم جمعه من حيوانات الاختبار أو البشر. قد يحتوي بول الحيوانات المعالجة أو المرضى الذين عولجوا باستخدام ASOs من الجيل الثاني على نواتج أيضية تتراوح من محتملتين 15-Mer إلى اثنين من 5-Mer محتملتين MOE ومجموعات متعددة من كل من المستقلبات الوسيطة.

ستكون المستقلبات الأقصر من طول نهايات MOE موجودة في الأنسجة إذا كانت نهايات MOE هي نفسها ركائز للنوكلييز. عادة لا يتم الكشف عن هذه المستقلبات عن طريق التحليل الطيفي الكتلي ، مما يشير إلى أنه ، كقاعدة عامة ، لا يتم إطلاق مونوكليوتيدات MOE أثناء عملية التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، هناك بعض الاستثناءات لهذا التعميم. لعدد محدود من متواليات النوكليوتيدات , تمت ملاحظة زخارف النوكليوتيدات المفردة من الجيل الثاني ASO في الأنسجة والبلازما – إما CGE أو LC / MS: يبدو أن المستقلبات ناتجة عن هضم نوكلياز خارجي. يمكن ملاحظة هذه المستقلبات في التوزيع الأولي. من المفترض أنها تظهر بسرعة في بلازما الدم. مونوكليوتيدات MOE ، التي تتشكل أثناء التمثيل الغذائي ، ليست ركائز الفسفرة ، وبالتالي من غير المرجح أن يتم تضمينها في النيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات ، وفي النهاية ، في النيوكليوتيدات الذاتية. مونوكليوتيدات MOE لا تمنع الإنزيمات المسؤولة عن تخليق الحمض النووي. وبالتالي ، لا ينبغي دمج أحادي نيوكليوتيدات MOE ، إذا تشكلت ، في النيوكليوتيدات الذاتية.

يخضع الجزء المركزي من الديوكسينوكليوتيدات للجيل الثاني من ASO لانقسام نوكلياز خارجي ، مما يؤدي إلى إطلاق نوكليوتيد واحد. تتطابق أحادي أكسيد النوكليوتيدات ، التي يتم إنتاجها عن طريق انقسام نوكلياز خارجي ، مع النيوكليوتيدات الذاتية ، باستثناء مجموعة ثيوفوسفات ، التي قد تكون موجودة نظريًا. ومع ذلك ، فإن مجموعة الثيوفوسفات قابلة للأكسدة وفقدان الكبريت ، مما يجعل مجموعة الفوسفات النهائية مماثلة للنيوكليوتيدات الذاتية. لذلك ، على عكس مونوكليوتيدات MOE ، سيتم تضمين أي ديوكسينوكليوتيد تم إطلاقه بشكل طبيعي في المستودع داخل الخلايا للنيوكليوتيدات الذاتية. ستكون النيوكليوتيدات التي تحتفظ بمجموعات الثيوفوسفات بمثابة ركائز لإضافة مجموعة واحدة أو مجموعتين من الفوسفات ، مما ينتج عنه خليط نيوكليوتيد ثيوفوسفات ثنائي أو ثلاثي الفوسفات. الفسفرة ممكنة ، لكن وجود ألفا ثيوفوسفات يجعل التفاعلات الديناميكية الحرارية غير مواتية.

استنتاج

إن أهمية دراسة الحرائك الدوائية للبيانات والأدوية المشابهة لتلك الموصوفة واضحة ، بالإضافة إلى إنشاء نماذج على أنواع حيوانية مختلفة لفهم العمليات التي تحدث في الجسم بعد تناول الأدوية بشكل كامل. في روسيا ، دراسات هذه الأدوية جارية أيضًا.

المؤلفات

1. Adjei A.A. ، Dy G.K. ، Erlichman C. et al. تجربة المرحلة الأولى من ISIS 2503 ، مثبط مضاد للحساسية لـ H-ras ، بالاشتراك مع gemcitabine في مرضى السرطان المتقدم. // عيادة. الدقة السرطان. 2003 المجلد. 9 ، رقم 1. ص 115.

2. Benimetskaya L. ، Loike J.D. ، Loike G. et al. Mac-1 (CD11b / CD18) هو بروتين مرتبط بـ ODN. // نات. ميد. 1997 المجلد. 3 ، لا .4. ص 414.

3. Benimetskaya L. ، Tonkinson J.L. ، Koziolkiewicz M. et al. ربط الـ ODNs الفوسفوروثيوات بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، CD4 القابل للذوبان المؤتلف ، اللامينين والفيبرونيكتين في P-chirality المستقلة. // نوكل. الدقة الأحماض. 1995 المجلد. 23 ، لا .21. ص 4239.

4. Bijsterbosch M.K. ، Manoharan M. ، Rump E.T. وآخرون. في مصير المختبر من ODNs المضادة للفوسفوروثيوات: امتصاص سائد من قبل مستقبلات الزبال على الخلايا البطانية. // نوكل. الدقة الأحماض. 1997 المجلد. 25 ، لا .16. ص 3290.

5. Bijsterbosch M.K.، Rump ET، De Vrueh R.L. وآخرون. تعديل ارتباط بروتين البلازما وامتصاص خلايا الكبد في المختبر من الفوسفوروثيوات ODN عن طريق اقتران الكوليسترول. // نوكل. الدقة الأحماض. 2000 المجلد. 28 ، رقم 14. ص 2717.

6. Brown DA، Kang S.H.، Gryaznov S.M. وآخرون. تأثير تعديل الفسفوروثيوات في ODNs على ارتباط بروتين معين. // جيه بيول. علم. 1994 المجلد. 269 ​​، رقم 43. ر 26801.

7. بتلر إم ، كروك آر إم ، جراهام إم جي. وآخرون. توزع ODNs الفوسفوروثيوات بالمثل في الفئة A مستقبلات الزبال بالضربة القاضية والفئران البرية. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 2000 المجلد. 292 ، رقم 2. ص 489.

8. بتلر إم ، هايز سي إس ، تشابيل إيه ، موراي إس إف ، ياكش تل ، هوا إكس واي. توزيع العمود الفقري والتمثيل الغذائي لـ 2_-O- (2-methoxyethyl) - ASOs المعدل بعد الإعطاء داخل القراب في الفئران. // علم الأعصاب. 2005 المجلد. 131 ، رقم 3. ص 705.

9. بتلر إم ، ستيكر ك ، بينيت سي إف. التوزيع الخلوي لـ ODNs الفوسفوروثيوات في أنسجة القوارض الطبيعية. //مختبر. يستثمر. 1997 المجلد. 77 ، لا .4. ص 379.

10. Cossum PA و Sasmor H. و Dellinger D. et al. التخلص من الفوسفوروثيوات المسمى 14C ASO ISIS 2105 بعد الحقن الوريدي للجرذان. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1993 المجلد. 267 ، رقم 3. ص 1181.

11. كوسوم P.A. ، ترونج L. ، أوينز S.R. وآخرون. حركية الدواء لمادة فوسفوروثيوات ASO التي تحمل علامة 14C ، ISIS 2105 ، بعد تناولها داخل الأدمة للفئران. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1994 المجلد. 269 ​​، رقم 1. ص 89.

12. كروك إس تي ، جراهام إم جي ، زوكرمان ج. وآخرون. خصائص حركية الدواء للعديد من نظائر ASO الجديدة في الفئران. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1996 المجلد. 277 ، رقم 2. ص 923.

13. Driver S.E. ، Robinson GS ، Flanagan J. ، Shen W. ، Smith L.E.H. ، Thomas D.W. ، Roberts P.C. تثبيط قائم على ASO للتعبير الجيني الجنيني. // نات. التكنولوجيا الحيوية. 1999 المجلد. 17. ص 1184.

14. Eckstein F. Phosphorothioate ODNs: ما هو أصلها وما الذي يميزها؟ // مضاد المعنى Nucl. تطوير المخدرات الحمضية. 2000 المجلد. 10 ، رقم 2. ص 117.

15. Gaus H.J.، Owens S.R.، Winniman M.، Cooper S.، Cummins L.L. مطياف الكتلة بالرش الكهربائي HPLC على الإنترنت لمستقلبات ASO الفوسفورية. // الشرج. علم. 1997 المجلد. 69 ، لا .3. ص 313.

16. جيري آر. التقييم الحالي لعلاقات PK / PD للمعالجات المضادة للحساسية. // المؤتمر العالمي للصيدلة والعلوم الصيدلانية ، نيس ، فرنسا ، 2002.

17. جيري آر إس ، برادلي جيه دي ، واتانابي تي وآخرون. عدم وجود تفاعل الحرائك الدوائية لـ ISIS 113715 ، وهو 2_O- ميثوكسي إيثيل معدّل أوليغنوكليوتيد مضاد للحساسية يستهدف بروتين التيروزين الفوسفاتيز 1B messenger RNA ، مع المركبات المضادة لمرض السكر عن طريق الفم ميتفورمين ، غليبيزيد أو روزيجليتازون. // عيادة. حركية الدواء. 2006 المجلد. 45 ، لا .8. ص 789.

18. جيري رس ، ليدز ج.م. ، فيتشيت جيه وآخرون. الحرائك الدوائية والتمثيل الغذائي في فئران مثبط مضاد للفوسفوروثيوات ASO لتعبير C-raf-1 كيناز. // Drug Metab. التخلص. 1997 المجلد. 25 ، لا .11. ر 1272.

19. جيري آر إس ، ليدز جي إم ، هنري إس بي ، مونتيث دي كيه ، ليفين إيه إيه. مثبطات oligonucleotide antisense لعلاج السرطان: 1. الخواص الحركية الدوائية لـ ODNs الفوسفوروثيوات. // دواء مضاد للسرطان. 1997 المجلد. 12 ، لا .5. ر 383.

20. جيري رس ، ليدز ج.م. ، شاناهان دبليو وآخرون. تسلسل الحرائك الدوائية للبلازما والأنسجة المستقلة لـ 3 ASOs الفوسفوروثيوات المضادة للحساسية: فأر للإنسان. // في الرابطة الأمريكية لعلماء الصيدلة ، فارم. Research ، Plenum Press ، سياتل ، واشنطن. 1996. R. S.

21. جيري آر إس ، تنج سي إل ، ترونج إل وآخرون. قم أولاً بتمرير الاستخراج الكبدي لأوليغنوكليوتيدات خيمرية معدلة جزئيًا في كلاب بيغل. // في الاجتماع السنوي للجمعية الأمريكية لعلماء الصيدلة ، إنديانابوليس ، إنديانا ، 2000. ص 216.

22. Geary RS ، Ushiro-Watanabe T. ، Truong L et al. الخصائص الحركية الدوائية لنظائر ASO المعدلة 2_-O- (2-methoxyethyl) في الفئران. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 2001 المجلد. 296 ، رقم 3. ر 890.

23. Geary RS، Yu R.Z.، Levin A.A. الحرائك الدوائية لأدوات ODN المضادة للفوسفوروثيوات. // بالعملة رأي. يستثمر. المخدرات. 2001 المجلد. 2 ، رقم 4. ص 562.

24. Geary RS ، Yu R.Z. ، Watanabe T. et al. الحرائك الدوائية لعامل نخر الورم ألفا فوسفوروثيوات 2_-O- (2-ميثوكسي إيثيل) أليغنوكليوتيد مضاد المعنى المعدل: مقارنة بين الأنواع. // دواء ميتاب. التخلص. 2003 المجلد. 31 ، رقم 11. ص 1419.

25. Giacomini K.M.، Sugiyama Y. ناقلات الغشاء والاستجابة للأدوية ، في Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics، 11th ed.، Brunton، L.L.، ed.، McGraw-Hill، New York، 2006. P. 41.

26. جليف م. ، تشي ك. الضربة القاضية للجين الوقائي للخلايا ، Clusterin ، لتعزيز الهرمون والحساسية الكيميائية في البروستاتا وسرطانات أخرى. // آن. نيويورك أكاد. الخيال. 2005. المجلد 1058. ص 1.

27. Gleave M.، Miyake H. استخدام قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية التي تستهدف الجين الواقي للخلايا ، العنقرين ، لتعزيز حساسية الأندروجين والكيمياء في سرطان البروستاتا. // العالم J. 23. 2005. رقم 1. ص 38.

28. Glover J.M.، Leeds J.M.، Mant T.G. وآخرون. المرحلة الأولى من السلامة والحركية الدوائية لجزيء الالتصاق بين الخلايا -1 ODN المضاد للحساسية (ISIS 2302). // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1997 المجلد. 282 ، رقم 3. ر 1173.

29. Graham M.J.، Crooke ST.، Monteith D.K. وآخرون. التوزيع في المختبر والتمثيل الغذائي للفوسفوروثيوات ASO داخل كبد الفئران بعد الإعطاء في الوريد. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1998 المجلد. 286 ، رقم 1. ص 447.

30. Guvakova M.A.، Yakubov L.A.، Vlodavsky I.، Tonkinson J.L.، Stein C.A. ترتبط ODNs الفسفوروثيواتية بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، وتمنع ارتباطها بمستقبلات سطح الخلية ، وتزيلها من مواقع الارتباط منخفضة التقارب على المصفوفة خارج الخلية. // جيه بيول. علم. 1995 المجلد. 270. ص 2620.

31. Henry S.P.، Denny K.H.، Templin M.V.، Yu R.Z.، Levin A.A. آثار مثبطات قليل النوكليوتيد البشرية والفئران لـ ICAM-1 على الأداء التناسلي ، ونمو الجنين ، وتطور ما بعد الولادة في الفئران. // الدقة الخلقية. بدف. التكاثر. توكسيكول. 2004 المجلد. 71 ، رقم 6. ص 359.

32. Hua X.Y. ، Moore A. ، Malkmus S. et al. يؤدي تثبيط تعبير بروتين كيناز سي ألفا في العمود الفقري عن طريق قليل النوكليوتيد المضاد للتأثير إلى إضعاف التسامح الناجم عن تسريب المورفين. // علم الأعصاب. 2002 المجلد. 113 ، رقم 1. ص 99.

33. Jackson J.K.، Gleave ME، Gleave J.، Burt H.M. تثبيط تكوين الأوعية عن طريق قليلات النوكليوتيدات المضادة للحساسية إلى العنقدين. // تولد الأوعية الدموية. 2005 المجلد. 8 ، لا .3. ص 229.

34. Kastelein J.J.P.، Wedel M.K.، Baker B.F. وآخرون. انخفاض قوي في صميم البروتين الدهني B وكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة عن طريق الإدارة قصيرة المدى لمثبط مضاد للبروتين البروتيني ب. // الدورة الدموية. 2006 المجلد. 114 ، رقم 16. ص 1729.

35. Koziolkiewicz M.، Krakoviak A.، Kwinkowski M.، Boczkowska M.، Stec W.J. الاختلاف التجسيمي - تأثير P chirality of oligo (nucleoside phosphorothioates) على نشاط البكتيريا RNase H. // Nucl. الدقة الأحماض. 1995. المجلد 23 ، رقم 24. ر 5000.

36. Leeds J.M.، Geary RS. الخصائص الحركية الدوائية لـ ASOs الفسفوروثيوات في البشر ، في البحث والتطبيقات المضادة للحساسية ، الطبعة الأولى ، Crooke ، S. T. ، ed. ، Springer ، Heidelberg ، 1998. P. 217.

37. Leeds J.M.، Henry S.P.، Geary RS، Burckin T.A.، Levin A.A. مقارنة بين الحرائك الدوائية للإعطاء تحت الجلد والوريد لأوليجودوكسينيوكليوتيد الفوسفوروثيوات في قرود سينومولجوس. // مضاد المعنى Nucl. تطوير المخدرات الحمضية. 2000. المجلد 10 ، رقم 6. ر 435.

38. ليفين أ. مراجعة للقضايا المتعلقة بالحرائك الدوائية وعلم السموم لأوليغنوكليوتيدات الفوسفوروثيوات المضادة للحساسية. // بيوكيم. بيوفيز. اكتا. 1999. المجلد 1489 ، رقم 1. ص 69.

39. Levin A.A.، Geary RS، Leeds J.M. وآخرون. الحرائك الدوائية وسمية ASOs الفوسفوروثيوات ، في التكنولوجيا الحيوية وتقييم السلامة ، الطبعة الثانية ، توماس ، ج. أ ، محرر ، تايلور وفرانسيس ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، 1998. ص 151.

40. Levin A.A.، Henry S.P.، Bennett C.F. وآخرون. التطوير قبل السريري للعلاجات المضادة للمعنى ، في العلاجات الجديدة من التكنولوجيا الحيوية الحديثة: من المختبر إلى الاختبار البشري ، الطبعة الأولى ، Oxender D.L. and Post L.E.، eds.، Springer-Verlag، Heidelberg، Germany، 1998، p.131.

41. ليفين أ.أ. ، هنري س.ب. ، مونتيث د. ، تمبلن م. // in Antisense Drug Technology، Crooke، S. T.، ed.، Marcel Dekker، New York، 2001. P. 201.

42. Loke S.L.، Stein C.A.، Zhang X.H. وآخرون. توصيف انتقال ASO إلى الخلايا الحية. // بروك. ناتل. أكاد. الخيال. الولايات المتحدة الأمريكية. 1989 المجلد. 86. ص 3474.

43. Lorenz P.، Misteli T.، Baker B.F.، Bennett C.F.، Spector D.L. النقل المكوكي Nucleocytoplasmic: خاصية جديدة في المختبر لـ ODNs الفوسفوروثيوات المضادة للحساسية. // نوكل. الدقة الأحماض. 2000 المجلد. 28 ، لا .2. ص 582.

44. مينر بي بي ، جيري آر إس ، ماتسون جيه وآخرون. التوافر البيولوجي والنشاط العلاجي للأليكفورسن (ISIS 2302) كان يُعطى كحقنة شرجية للاحتفاظ بالمستقيم للمرضى المصابين بالتهاب القولون التقرحي النشط. // مرض فارماكول. هناك. 2006 المجلد. 23 ، لا .10. ص 1427.

45. Mou T.C.، Gray D.M. يتم تعديل تقارب الارتباط العالي لأوليغومرات الفوسفوروثيوات المعدلة لبروتين الجين 5 من Ff عن طريق إضافة تعديلات C-5 propyne أو 2_-O-methyl. // نوكل. الدقة الأحماض. 2002 المجلد. 30 ، لا .3. ر 749.

46. ​​Nicklin P.L.، Craig S.J.، Phillips J.A. الخصائص الحركية الدوائية للفوسفوروثيوات في امتصاص الحيوانات ، والتوزيع ، والتمثيل الغذائي والقضاء ، في البحث والتطبيقات المضادة للحساسية ، الطبعة الأولى ، كروك ، S. T. ، ed. ، Springer ، Berlin ، 1998. P. 141.

47. بينغ ب ، أندروز جيه ، نيستوروف آي وآخرون. توزيع الأنسجة والحركية الدوائية القائمة على أساس فسيولوجي للفوسفوروثيوات المضادة للفوسفات ASO ISIS 1082 في الفئران. // مضاد المعنى Nucl. تطوير المخدرات الحمضية. 2001 المجلد. 11 ، رقم 1. ص 15.

48. فيليبس ج.أ ، كريج س.ج. ، بايلي د. وآخرون. حركية الدواء والتمثيل الغذائي والتخلص من 20 مير فوسفوروثيوات ODN (CGP 69846A) بعد الحقن في الوريد وتحت الجلد. // Biochem. فارماكول. 1997 المجلد. 54 ، رقم 6. ر 657.

49. Sawai K. ، Mahato R.I. ، Oka Y. ، Takakura Y. ، Hashida M. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 1996 المجلد. 279 ، رقم 1. ص 284.

50. Sewell L.K.، Geary RS، Baker B.F. وآخرون. المرحلة الأولى من تجربة ISIS 104838 ، أليغنوكليوتيدات 2_ ميثوكسي إيثيل المعدلة المضادة للحساسية تستهدف عامل نخر الورم ألفا. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 2002 المجلد. 303 ، رقم 3. ر 1334.

51 Slim G.، Gait M.J. محدد تشكيليا يحتوي على قليل النوكليوتيدات المحتوية على الفوسفوروثيوات في دراسة آلية انقسام ريبوزيمات رأس المطرقة. // نوكل. الدقة الأحماض. 1991 المجلد. 19 ، لا .6. ر 1183.

52. سنايدر آر إم ، ميرابيلي سي كيه ، كروك إس تي. الارتباط الخلوي ، والتوزيع داخل الخلايا ، وتدفق auranofin عبر تفاعلات تبادل الترابط المتسلسل. // Biochem. فارماكول. 1986 المجلد. 35 ، لا .6. ص 923.

53. Soucy N.V.، Riley J.P.، Templin M.V. وآخرون. توزيع الأم والجنين من الفوسفوروثيوات ASO في الفئران بعد التسريب في الوريد. // الدقة الخلقية. بدف. التكاثر. توكسيكول. 2006 المجلد. 77 ، لا .1. ص 22.

54. Spitzer S.، Eckstein F. تثبيط deoxyribonucleases بواسطة مجموعات phosphorothioate في oligodeoxyribonucleotides. // نوكل. الدقة الأحماض. 1988 المجلد. 16 ، رقم 24. ر 11691.

55. Stavchansky S.، Geary RS، Cho M. Pharmacokinetics and hepatic first pass effect of a oligonucleotide antisense (ISIS 2302) في الفئران. // في الاجتماع السنوي للجمعية الأمريكية لعلماء الصيدلة ، إنديانابوليس ، إنديانا ، 2000. ص 216.

56. Templin M.V.، Levin A.A.، Graham M.J. وآخرون. ملف تعريف الحركية الدوائية والسمية لـ ASO الفسفوري بعد الاستنشاق إلى الرئة في الفئران. // مضاد المعنى Nucl. تطوير المخدرات الحمضية. 2000 المجلد. 10 ، لا .5. ص 359.

57. Teplova M. ، Minasov G. ، Tereshko V. et al. التركيب البلوري وخصائص مضادات المعنى المحسنة لـ 2_-O- (2-methoxyethyl) -RNA. // نات. هيكل. بيول. 1999. المجلد 6 ، رقم 6. R.535.

58. Villalona-Calero M.A.، Ritch P.، Figueroa J.A. وآخرون. دراسة المرحلة الأولى / الثانية من LY900003 ، وهو مثبط مضاد لبروتين كيناز سي ألفا ، بالاشتراك مع سيسبلاتين وجيمسيتابين في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة المتقدمة. // عيادة. الدقة السرطان. 2004 المجلد. 10 ، رقم 18 جزء 1. ص 6086.

59. Watanabe T.A.، Geary RS، Levin A.A. ارتباط بروتين البلازما بأوليغنوكليوتيد مضاد للحساسية يستهدف الإنسان ICAM-1 (ISIS 2302). // ASOs. 2006 المجلد. 16 ، لا .2. ص 169.

60. White A.P. ، Reeves K.K. ، Snyder E. et al. ترطيب فوسفوديستر أحادي الجديلة وفوسفوروثيوات أليغودوكسي ريبونوكليوتيدات. // نوكل. الدقة الأحماض. 1996 المجلد. 24 ، رقم 16. ر 3261.

61. ويلسون د. ثالثًا ، نشاط نوكلياز داخلية أهلية Ape1 ينظمه تركيزات المغنيسيوم والبوتاسيوم وهو قوي على هياكل الحمض النووي البديلة. // جيه مول. بيول. 2005 المجلد. 345 ، رقم 5. ص 1003.

62. Yu D. ، Kandimalla ER ، Roskey A. et al. شبكات ODN المخصبة بالستيريو: التوليف والخصائص الفيزيائية الحيوية والبيولوجية. // Bioorg. ميد. علم. 2000. المجلد 8 ، رقم 1. ص 275.

63. Yu R.Z. ، Baer B. ، Chappel A. et al. تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم غير التنافسي والتهجين غير التنافسي من أجل تحديد ODN الفوسفوريثيوات في البلازما. // الشرج. بيوتشيم. 2002 المجلد. 304 ، رقم 1. ص 19.

64. Yu R.Z.، Geary RS، Leeds J.M. وآخرون. مقارنة بين الحرائك الدوائية والتخلص من الأنسجة لمضاد الفوسفوروثيوات ASO الذي يستهدف Haras mRNA البشري في الفأر والقرد. // جى فارم. الخيال. 2001 المجلد. 90 ، رقم 2. ص 182.

65. Yu R.Z.، Geary RS، Levin A.A. تطبيق طرق التحليل الحيوي الكمي الجديدة للتقييمات الحركية الدوائية والحركية الدوائية / الديناميكية الدوائية لأوليغنوكليوتيدات مضادات المعنى. // بالعملة رأي. ديسكوف المخدرات. ديف. 2004 المجلد. 7 ، رقم 2. ر 195.

66. Yu R.Z. ، Kim T.W. ، Hong A. et al. مقارنة الحرائك الدوائية عبر الأنواع من الفأر إلى الإنسان من الجيل الثاني من قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية ISIS 301012 ، تستهدف صميم البروتين البشري B-100. // دواء ميتاب. التخلص. 2007 المجلد. 35. ص 460.

67. Yu R.Z.، Zhang H.، Geary RS. وآخرون. الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية لمضاد الفوسفوروثيوات ASO الذي يستهدف Fas mRNA في الفئران. // J. فارماكول. إكسب. هناك. 2001 المجلد. 296 ، رقم 2. ص 388.

68. Zinker B.A.، Rondinone C.M.، Trevillyan J.M. وآخرون. يخفض أليغنوكليوتيد PTP1B المضاد للحساسية بروتين PTP1B ، ويعيد مستوى السكر في الدم إلى طبيعته ، ويحسن حساسية الأنسولين في الفئران المصابة بداء السكري. // بروك. ناتل. أكاد. الخيال. الولايات المتحدة الأمريكية. 2002 المجلد. 99 ، رقم 17. ص 1137.

الاتجاه الواعد هو تطوير التقنيات الجينية.

1. هم قادرون على تحسين العلاج الدوائي التقليدي (علم الصيدلة الجيني) بشكل ملحوظ.

2. تعليق آمال خاصة على تطوير الهندسة الوراثية للأدوية للوقاية من الأمراض المعدية ومسببات الأمراض.

مجال آخر هو الاستعدادات التكنولوجية الحيوية. بدأت المنافسة بين الأدوية الاصطناعية التقليدية والمستحضرات الصيدلانية الحيوية. أصبح المصطلح الجديد "الصيدلة الحيوية" مألوفًا.

في عام 2006 ، بلغ حجم السوق الدوائية العالمية حوالي 640 مليار دولار أمريكي ، في حين أن 10٪ منها تمثل بالفعل منتجات التكنولوجيا الحيوية. الرواد في مجال الصيدلة الحيوية هم الولايات المتحدة الأمريكية وألمانيا.

سبق تطوير المستحضرات الصيدلانية الحيوية الحديثة تطوير طرق التكنولوجيا الحيوية الأخرى ، لا سيما تخمير البكتيريا والفطريات ، مما سمح بتطوير الإنتاج الصناعي للأدوية ذات الوزن الجزيئي الصغير ، مثل المضادات الحيوية ومثبطات اختزال HMG-CoA (هيدروكسي- methylglutaryl-coenzyme A-reductase) ومثبطات المناعة. المنتجات الطبية التي تعتمد على التكنولوجيا الحيوية هي منتجات طبية مخصصة للوقاية أو العلاج أو التشخيص في الجسم الحي ، والتي تطور نشاطًا بيولوجيًا وليس دوائيًا. لديهم عدد من الاختلافات الهامة عن العقاقير الكيميائية الاصطناعية. المادة الفعالة من مستحضرات التكنولوجيا الحيوية هي من أصل بيولوجي ومشتقة من الخلايا الحية ولها بنية جزيئية غير متجانسة معقدة. تعمل الخلايا من أصل حيواني أو الكائنات الحية الدقيقة (مثل بكتيريا الإشريكية القولونية ، الخميرة ، إلخ) كركيزة أولية ، ويتم استخدام هياكلها الخلوية وشبه الخلوية.

يتمثل الاختلاف الأساسي بين أدوية التكنولوجيا الحيوية في أنها تستخدم القدرة الطبيعية على التمثيل الغذائي.

للحصول عليها ، يتم عزل الحمض النووي الجيني للمنتج الأصلي وتعديله بحيث يكتسب قدرة جديدة وغير محددة لهذا النوع على التخليق الحيوي ، والتي تستخدم في الأدوية. بادئ ذي بدء ، يجب أن نذكر هنا إنشاء كائنات معدلة وراثيًا لإنتاج البروتينات العلاجية المؤتلفة. يوجد حاليًا 115 دواءًا تعتمد على 84 بروتينًا علاجيًا قيد الاستخدام. في عام 2006 ، كان هناك 418 دواءً بيولوجيًا قيد التطوير في الولايات المتحدة و 320 دواءً في أوروبا ، بعضها قيد التجارب السريرية بالفعل وستكون متاحة قريبًا للأطباء ومرضاهم. وفقًا للتوقعات المتفائلة ، في عام 2015 ، ستعتمد نصف الأدوية المبتكرة في العالم على البروتينات أو أليغنوكليوتيدات. يجب أن نتوقع أيضًا دخول فئة جديدة من الأدوية إلى السوق الصيدلانية - البدائل الحيوية - نظائرها من عقاقير التكنولوجيا الحيوية الأصلية بجزيء نشط مشابه ولكنه غير متطابق. في الاتحاد الأوروبي هذا العام ، تم تسجيل أول بدلين بيولوجيين (هرمون النمو - سوماتوتروبين). تم تسجيل حوالي 12 بديلاً بيولوجيًا (إرثروبويتين ، إلخ) لدى وكالة الأدوية الأوروبية. من المتوقع أن يؤدي إدخال البدائل الحيوية في الممارسة الطبية إلى تقليل تكاليف الرعاية الصحية لأدوية التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير وجعلها في متناول عامة السكان. في أيدي الأطباء ستكون الأدوية أكثر فاعلية لمكافحة الأمراض الخطيرة ، والتي كان كثير منها يعتبر سابقًا غير قابل للشفاء.

النيوكليوتيدات- استرات الفسفوريك للنيوكليوسيدات والنيوكليوزيدات الفوسفاتية. تلعب النيوكليوتيدات الحرة ، ولا سيما ATP و cAMP و ADP ، دورًا مهمًا في الطاقة والعمليات المعلوماتية داخل الخلايا ، وهي أيضًا مكونات للأحماض النووية والعديد من الإنزيمات المساعدة.

تسمى المركبات المكونة من جزيئين من النوكليوتيدات ثنائي النوكليوتيدات، من أصل ثلاثة ثلاثي النوكليوتيدات، من عدد صغير - قليل النوكليوتيدات، ومن بين الكثير عديد النوكليوتيدات، أو الأحماض النووية.

مورفولينو(إنجليزي) مورفولينو) هي أوليغنوكليوتيدات اصطناعية مستخدمة في البيولوجيا الجزيئية لتغيير التعبير الجيني. تُستخدم المورفولينوس قليلة القسيمات المضادة لتحسّس لمنع الجزيئات الأخرى من الوصول إلى تسلسلات حمض نووي محددة. يحجب مورفولين أليغنوكليوتيدات مناطق صغيرة وحيدة الجديلة (حوالي 25 نيوكليوتيد) على سطح جزيئات الحمض النووي الريبي.

أليغنوكليوتيدات مضادات المعنىهي سلاسل طويلة من نيوكليوتيدات الدنا في الكروموسومات. إذا تم التعبير عن الجين ، تبدأ عملية نسخ هذا الجين ، ونتيجة لذلك يتم تصنيع الرنا المرسال.

يعتمد التأثير العلاجي للأوليغنوكليوتيدات الاصطناعية المضادة للحساسية على خصوصية تهجينها مع الموقع الذي يمكن الوصول إليه لهدف m RNA ، ومقاومة عمل نوكليازات الخلية ، ووجود نظام توصيل في الخلية.

حتى الآن ، يتم تنفيذ الإغلاق المستهدف الأكثر فعالية لنشاط مناطق معينة من الجينوم بواسطة أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى (AONs). تعتمد استراتيجية استخدام AON على تفاعل Watson-Crick بين جزيئات DNA مع مرنا الهدف. يؤدي تكوين مضاعف مضاعف DNA-mRNA إلى تعطيل M-RNA والوقف اللاحق لتخليق البروتين.

بمعنى آخر ، تشير آلية مضادات المعنى إلى ارتباط قليل النوكليوتيد بالموقع التكميلي للحمض النووي الريبي المستهدف وقمع الوظيفة داخل الخلايا لهذا الحمض النووي الريبي.

ومع ذلك ، تبين أن هذا النموذج النظري البسيط والجذاب أكثر تعقيدًا في الواقع. تُعرف ثلاثة أنواع من الجزيئات المضادة للحساسية: قليل النوكليوتيدات الاصطناعية القصيرة نسبيًا ؛ RNA المضاد المعبر عنه في الخلية بعد تعداء مع جين ريبوزيم مضاد ، والذي له نشاط تحفيزي.

يعد إنشاء عقاقير تعتمد على أليغنوكليوتيدات مضادات المعنى أحد أحدث الاتجاهات في تطوير الأدوية. تتيح هذه التقنية للباحث الفرصة للتأثير بشكل مباشر تقريبًا على أي عملية في الخلية بأعلى دقة. إذا كان بروتين معين يشجع على نمو خلية سرطانية ، فعند استخدام قليل النوكليوتيد المضاد المناسب ، يمكن التأكد من أن هذا البروتين لن يتم تصنيعه في الخلية مرة أخرى. قليل النوكليوتيدات المضادة للحساسية محددة لدرجة أنه من المستحيل تقريبًا أن يتأثر أي بروتين آخر في الخلية. ستقلل هذه الخصوصية من الآثار الجانبية التي تظهر غالبًا مع علاجات السرطان التقليدية.

آلية التعطيل لا تزال غير واضحة تماما. ولكن ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة غير معهود من الخلايا الطبيعية. نظرًا لأن إشارة تخليق كل بروتين هي mRNA واحد ، يمكن إيقاف أو "إيقاف" إشارة بروتين معين باستخدام مثل هذا التسلسل التكميلي.

الشكل 4 آلية عمل قليل النوكليوتيد المضاد للحساسية

تتمثل إحدى المشكلات المهمة في العلاج بالعقاقير التي تعتمد على أليغنوكليوتيدات المضادة للحساسية في تدمير هذه الأدوية بواسطة إنزيمات الخلية - نوكليازات. تتحلل أوليغوديوكسونوكليوتيدات بواسطة نوكليازات ، لذلك من المهم جدًا حمايتها من تأثير الأخيرة حتى لا تفقد قدرتها على التهجين مع الهدف. للقيام بذلك ، يتم إجراء الفصل الكهربي للبروتينات الخلوية ، حيث يتم تضمين ملصق إشعاعي أثناء الترجمة ، ويتم استخدام التصوير الإشعاعي لتحديد أي من قليل النوكليوتيدات "المضاد للحساسية" يقلل من تخليق بروتين معين. لا توجد معايير عامة لاختيار أفضل المواقع المستهدفة في نسخ مختلفة من الحمض النووي الريبي. قليل النوكليوتيدات المكملة لـ 5'- أو 3'-konp mRNA ، حدود exon و intron ، وحتى المناطق المزدوجة تقطعت بهم السبل قد تكون فعالة. تتحلل أوليغوديوكسينوكليوتيدات بواسطة نوكليازات داخل الخلايا ؛ لذلك ، من المهم حمايتها من تأثير الأخير حتى لا تفقد قدرتها على التهجين مع الهدف. لهذا ، يمكن تعديل قواعد البيريميدين و deoxyribose بطريقة معينة.

وهكذا ، في أوليغنوكليوتيدات "المضادة للدلالة" الأكثر استخدامًا حاليًا ، يتم استبدال ذرة الأكسجين الحرة لرابطة الفوسفوديستر بمجموعة السلفو ، مما يؤدي إلى تكوين رابطة ثيوفوسفات. قليل النوكليوتيدات المعدلة بهذه الطريقة تذوب في الماء وتحمل شحنة سالبة ولا تنقسم بواسطة نوكليازات داخلية. عند التهجين مع الموقع المستهدف ، فإنها تشكل ازدواجًا من الحمض النووي الريبي والدنا الذي ينشط ريبونوكلياز (RNase) H ، وهو إنزيم داخلي يشق الرنا المرسال في الجزيء الهجين. تم إجراء التجارب السريرية الأولى لمثل هذه الأدوية من الجيل الأول قليل النوكليوتيدات. الأهداف هي الحمض النووي الريبي للفيروس المضخم للخلايا ، وفيروس نقص المناعة البشرية ، وكذلك الرنا المرسال للجينات المسؤولة عن تطور السرطان وأمراض الأمعاء وأمراض أخرى.

توليف أليغنوكليوتيدات "مضاد الحس" مع روابط الفوسفوراميديت والبولي أميد (الببتيد). هذه الجزيئات شديدة المقاومة لعمل النيوكليازات. تعمل المجموعات الكيميائية المرتبطة بذرة كربون 2 بوصة من بقايا السكر وذرة C-5 في البيريميدين أيضًا على حماية oligonucleotides المضادة للاندماج وتسهيل ارتباطها بالموقع المستهدف. ). تتم الآن دراسة جميع مزايا هذه التعديلات وغيرها بشكل مكثف.