Комплексна діагностика методом риф. Лабораторна діагностика сифілісу Пункція регіонарних лімфатичних вузлів

Нині широко застосовуються серологічні реакції, у яких беруть участь мічені АГ-и чи АТ-ла. До них відносяться реакції імунофлюоресценції, радіоімунний та імуноферментний методи.

Вони застосовуються:

1) для серодіагностики інфекційних захворювань, тобто для виявлення АТ за допомогою набору відомих кон'югованих (хімічно з'єднаних) з різними мітками (ферментами, флюорохромними барвниками) антигенів;

2) для визначення мікроорганізму або його серовару за допомогою стандартних мічених діагностичних антитіл (експрес-діагностика).

Готують сироватки імунізацією тварин відповідним АГ-м, потім виділяють імуноглобуліни і кон'югують їх зі барвниками, що світяться (флюорохромами), ферментами, радіоізотопами.

Мічені СР за специфічністю не поступаються іншим СР, а за своєю чутливістю вони перевершують усі СР.

Немає подібних матеріалів

Як мітки використовуються флюорохромні барвники, що світяться (ізотіоцінат флюорисцеїну та ін.).

Існують різні модифікації РІФ. Для експрес-діагностики інфекційних захворювань - для виявлення мікробів або їх антигенів у матеріалі, що досліджується, застосовується РІФ по Кунсу.

Виділяють два методи РІФ за Кунсом: прямий і непрямий.

Компоненти прямої РІФ:

1) досліджуваний матеріал (випорожнення, що відокремлюється носоглоткою та ін);

2) мічена специфічна імунна сироватка, що містить АТ-ла до шуканого антигену;

3) ізотонічний розчин натрію хлориду.

Мазок з досліджуваного матеріалу обробляють міченою антисироваткою.

Відбувається реакція АГ-АТ. При люмінесцентному мікроскопічному дослідженні на тій ділянці, де локалізуються комплекси АГ-АТ, виявляють флюоресценцію - світіння.

Компоненти непрямої РІФ:

1) досліджуваний матеріал;

2) специфічна антисироватка;

3) антиглобулінова сироватка (АТ-ла проти імуноглобуліну), мічена флюорихромом;

4) Ізотонічний розчин хлориду натрію.

Мазок з досліджуваного матеріалу спочатку обробляють імунною сироваткою до антигену, а потім - міченою антиглобулінової сироваткою.

Комплекси АГ-АТ, що світяться, - мічені АТ виявляються за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Перевага непрямого методу полягає в тому, що немає необхідності приготування широкого набору флюоресцирующих специфічних сироваток, а застосовується лише одна антиглобулінова сироватка, що флюорескує.

Також виділяють 4-компонентний різновид непрямий РІФ, коли додатково вводиться комплемент (сироватка морської свинки). При позитивній реакції утворюється комплекс АГ-АТ – мічені – АТ-комплемент.

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.) . Ці групи з'єднуються з вільними аміногрупами молекул антитіл, які не втрачають при обробці флуорохромом специфічної спорідненості до відповідного антигену. Утворені комплекси АГ-АТ стають добре видимими структурами, що яскраво світяться під люмінесцентним мікроскопом (рис. 7). За допомогою РІФ можна виявляти невеликі кількості бактеріальних та вірусних антигенів. Метод РІФ використовують у двох варіантах: прямий та непрямий метод.

Прямий метод заснований на безпосередньому поєднанні антигену з міченим антитілом. Непрямий метод – на поетапному виявленні комплексу АГ-АТ за допомогою флуоресцентних барвників. Перший етап полягає у освіті імунних комплексів певного антигену зі специфічними антитілами. Другий етап – у виявленні цього комплексу шляхом обробки його міченим антигаммаглобуліном.

Перевага РІФ – простота, висока чутливість, швидкість отримання результату. РІФ застосовується як метод ранньої експрес-діагностики грипу, дизентерії, малярії, чуми, туляремії, сифілісу та ін. Для проведення такого дослідження використовується люмінесцентний мікроскоп.

Радіоімунологічний аналіз (РІА)

РІА - один із найчутливіших методів імунодіагностики. Його застосовують для виявлення антигену вірусу гепатиту В, у хворих на вірусний гепатит. Для цього до досліджуваної сироватці додають референс-сироватку (сироватку, що містить антитіла до вірусу гепатиту В). Суміш інкубують 1-2 доби при температурі 40 °С, потім додають референс-антиген (антиген, мічений ізотопом 125 J) та продовжують інкубацію ще 24 години. До комплексу, що утворився, антиген-антитіло додають преципітуючі антиімуноглобуліни проти білків референс-сироватки, що призводить до утворення преципітату (рис. 8). Результат враховують за наявністю та числом імпульсів у преципітаті, зареєстрованих лічильником. За наявності в досліджуваній сироватці антигену, що зв'язався зі специфічними антитілами, останні не вступають у зв'язок з міченим антигеном і тому він не виявляється в преципітаті. Таким чином, в основу РІА покладено принцип конкурентної взаємодії визначеного антигену та відомої кількості міченого антигену з активними центрами антитіл. Як мітку використовуються радіоактивні ізотопи.

Залежно від техніки постановки виділяють два способи РІА.

1) Техніка "рідка фаза" (класичний РІА). Недолік цієї техніки постановки – необхідність

спеціального поділу вільного та пов'язаного міченого антигенів (або антитіл).

2) Техніка "тверда фаза".

АГ або АТ відомої специфічності зв'язуються на сорбентах (твердій фазі) – стінках полістиролової лунки або пластикової пробірки. На іммобілізований АГ (АТ) послідовно-ватепно сорбуються інші компоненти ІЧ.

Залежно від характеру реакції розрізняють такі методи:

1) Конкурентний метод – метод, заснований на конкуренції АГ.

Компоненти реакції:

а) визначається АГ (досліджуваний матеріал - кров, мокротиння та ін);

б) ідентичний до досліджуваного АГ антиген, мічений радіоізотопом;

в) специфічні АТ-ла відомої концентрації, пов'язані на сорбенті;

г) стандартний АГ (контрольний);

д) буферний розчин.

Спочатку реакцію вводять досліджуваний АГ. Відбувається утворення комплексу АГ-АТ лежить на поверхні сорбенту. Сорбент відмивають, потім вводять мічений АГ, Чим більший вміст АГ, що досліджується, тим менше міченого АГ зв'язується з АТ-м на поверхні сорбенту. Концентрацію міченого АГ визначають вимірюванням радіоактивності реакції за допомогою лічильників. Величина радіоактивності реакції буде обернено пропорційною кількості АГ в досліджуваній пробі.

2) Неконкурентний спосіб.

Компоненти реакції:

а) визначається АГ;

б) специфічний АТ-а відомої концентрації, пов'язаний з

ні на сорбенті;

в) ідентичні до зв'язаного антитіла антитіла, мічені

радіоізотопом;

г) стандартний АГ;

д) буферний розчин.

До зв'язаних АТ додають АГ, що досліджується. У процесі інкубації на сорбенті утворюються комплекси АГ-АТ. Сорбент відмивають від вільних компонентів та додають мічені АТ, які зв'язуються з вільними валентностями АГ-на у складі комплексу. Розмір радіоактивності пропорційна концентрації досліджуваного АГ.

3) «Сендвіч-метод» (непрямий метод) – найпоширеніший метод.

Компоненти:

а) досліджувана сироватка (або досліджуваний артеріальна гіпертензія);

б) АГ-и, пов'язані на сорбенті (або АТ-ла, пов'язані на сорбенті щодо АГ-а);

в) діагностичні АТ проти імуноглобулінів, мічені радіоізотопами;

г) контрольні сироватки (або АГ-и);

д) буферні розчини.

Досліджувані АТ-а (або АГ-и) реагують з твердофазними АГ-ми (АТ-ми), після чого інкубат видаляється і реакцію вводять мічені антиглобулінові АТ, які зв'язуються зі специфічними комплексами АГ-АТ на поверхні сорбенту. Розмір радіоактивності реакції прямо пропорційна кількості досліджуваного АТ (чи АГ).

Переваги РІА:

1) висока специфічність та чутливість;

2) простота техніки постановки;

3) точність кількісної оцінки результатів;

4) легко піддається автоматизації.

Недоліки: використання радіоактивних ізотопів.

Немає подібних матеріалів(

Імуноферментний метод (ІФА)

Метод використовується для виявлення антигенів за допомогою відповідних антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, b - галактозою або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою суміш додають субстрат і хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом, яке продукти деградації викликають хімічну модифікацію хромогену. При цьому хромоген змінює свій колір - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися (рис. 9).

Найбільш поширений твердофазний ІФА, при якому один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіло) сорбований на твердому носії. Як твердий носій використовуються мікропанелі з полістиролу. При визначенні антитіл у лунки з сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворих, антиглобулінову сироватку, мічену ферментом та суміш розчинів субстрату для ферменту та хромогену. Щоразу після додавання чергового компонента з лунок видаляють реагенти, що не зв'язалися шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змінюється колір хромогену розчину. Твердофазний носій можна сенсибілізувати як антигеном, а й антитілом. Тоді в лунки з сорбованими антитілами вносять шуканий антиген, додають імунну сироватку проти антигену, мічену ферментом, а потім - суміш розчинів субстрату для ферменту та хромогену.

ІФА застосовують для діагностики захворювань, викликаних вірусними та бактеріальними збудниками. Як мітку використовуються ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза та ін.

Індикатором реакції є здатність ферментів викликати кольорові реакції при дії відповідний субстрат. Наприклад, субстратом для пероксидазу є розчин ортофенілдіаміну.

Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА. Сутність ІФА аналогічна РІА.

Результати ІФА можна оцінити візуально та вимірюванням оптичної щільності на спектрофотометрі.

До переваг ІФА слід віднести:

відсутність контакту з радіоактивними речовинами;

Простота методів оцінки реакції;

Стабільність кон'югатів;

Легко піддається автоматизації.

Однак, порівняно з РІА, відзначають нижчу чутливість методу, але в деяких випадках чутливість перевищує РІФ та РІМ.

Як приклади наводяться такі типи ІФА:

Конкурентний тип.

Призначення.

Призначена для виявлення поверхневого антигену вірусу гепатиту В (НВЗ Пекло) у сироватках та плазмі крові при діагностиці вірусного гепатиту В та визначення носійства НВ5 Пекло.

Компоненти:

1) досліджуваний матеріал: сироватка або плазма крові;

2) антитіла до НВЗ Пекло, адсорбовані на поверхні лунки полістиролового мікропланшета;

3) коньюгат - мишачі моноклоніальні антитіла до НВз Пекло, мічені пероксидазою,

4) ортофенілендіамін (ОФД)-субстрат;

5) фосфатно-сольовий буфер;

6) контрольні сироватки:

Позитивна (сироватка з НВе Пекло);

Негативна (сироватка без НВЗ Пекло). Хід роботи

1) Внесення контрольних та досліджуваних сироваток.

2) Інкубація 1 годину за 37 «З.

3) Відмивання лунок.

4) Внесення кон'югату.

5) Інкубація 1 годину за 37 «З.

6) Відмивання лунок.

7) Внесення ОФД. За наявності НВз Пекло розчин у лунках жовтіє.

Облік ІФА проводять за оптичною густиною за допомогою фотометра. Ступінь оптичної щільності буде обернено пропорційної концентрації досліджуваних НВз Пекло.

Механізм

Реакція протікає у три фази:

1) НВз Пекло досліджуваної сироватки (плазми) зв'язується з гомологічними АТ, адсорбованими на поверхні лунки. Утворюється ІЧ АГ-АТ. (НВз Пекло - агл \ НВз АТ).

2) Антитіла НВз Пекло, мічені пероксидазою, зв'язуються з вільними детермінантами НВз Пекла комплексу АГ-АТ, що залишилися. Утворюється комплекс АТ-АГ-мічені АТ (ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, мічені пероксидазою).

3) ОФД взаємодіють (з пероксидазою) комплексу АТ-АГ-АТ та відбувається жовте фарбування.

Непрямий тип

Є основною тестовою реакцією діагностики ВІЛ-інфекції.

Ціль: серологічна діагностика ВІЛ-інфекції - виявлення антитіл до антигенів ВІЛ, Компоненти:

1) досліджуваний матеріал – сироватка крові;

2) синтетичні

Пункція регіонарних лімфатичних вузлів

Серологічна діагностика

• Реакція Вассермана (РВ),
• осадові реакції Кана та Закса-Вітебського (цитохолева),
• реакція на склі (експрес-метод),

• реакція іммобілізації блідих трепонем (РІБТ),
• реакція імунофлюоресценції (РІФ)

Реакція Вассермана (РВ)

Зазвичай РВ ставиться із двома чи трьома антигенами. Найбільш часто застосовується кардіоліпіновий антиген (екстракт з серця бика, збагачений холестерином і лецитином), що відрізняється високою чутливістю, і трепонемний антиген (оброблена ультразвуком завись анатогенних культуральних блідих трепонем). Спільно з реагінами сироватки крові хворого ці антигени утворюють імунний комплекс, здатний адсорбувати та пов'язувати комплемент. Для візуального визначення освіченого комплексу (реагін + антиген + комплемент) як індикатор застосовується гемолітична система (суміш еритроцитів барана з гемолітичною сироваткою). Якщо комплемент пов'язаний у 1 фазі реакції (реагін + антиген + комплемент), гемоліз не настає - еритроцити випадають у легко помітний осад (РВ позитивна). Якщо в 1 фазі комплемент не пов'язаний внаслідок відсутності у випробуваній сироватці реагінів, він буде використаний гемолітичною системою та відбудеться гемоліз (РВ негативна). Ступінь вираженості гемолізу при постановці РВ оцінюється плюсами: повна відсутність гемолізу ++++ або 4+ (РВ різко позитивна); гемоліз, що ледь почався +++ або 3+ (РВ позитивна); значний гемоліз або 2+ (РВ слабопозитивна); незрозуміла картина гемолізу ± (РВ сумнівна); повний гемоліз – (реакція Вассермана негативна).

Крім якісної оцінки РВ є кількісна постановка з різними розведеннями сироватки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагінів визначається максимальним розведенням, що ще дає різко позитивний (4+) результат. Кількісна постановка РВ має значення у діагностиці деяких клінічних форм сифілітичної інфекції, а також при проведенні контролю за ефективністю лікування. В даний час реакція Вассермана ставиться з двома антигенами (кардіоліпіновий та трепонемний озвучений штам Рейтера). Як правило, РВ стає позитивним на 5-6 тижні після зараження у 25-60% хворих, на 7-8 тижні - у 75-96%, на 9-19 тижні - у 100%, хоча останніми роками іноді раніше чи пізніше . При цьому титр реагінів поступово наростає і досягає максимальної величини (1:160-1:320 і вище) у разі появи генералізованих висипів (сифіліс вторинний свіжий). При позитивації РВ виставляється діагноз первинного серопозитивного сифілісу.
При вторинному свіжомута вторинному рецидивному сифілісі РВ позитивна у 100% хворих, але у виснажених хворих з ослабленим імунітетом може спостерігатися негативний результат. Згодом титр реагінів поступово знижується і при вторинному рецидивному сифіліс зазвичай не перевищує 1:80-1:120.
При третинному сифілісіРВ позитивна у 65-70% хворих і зазвичай спостерігається низький титр реагінів (1:20-1:40). При пізніх формах сифілісу (сифіліс внутрішніх органів, нервової системи) позитивна РВ спостерігається у 50-80% випадків. Титр реагінів коливається від 1:5 до 1:320.
При прихованому сифілісіпозитивна РВ відзначається у 100% хворих. Титр реагінів від 1:80 до 1:640, а при пізньому прихованому сифілісі від 1:10 до 1:20. Швидке зниження титру реагінів (до повної негативації) під час лікування свідчить про ефективність лікування.

Недоліки реакції Вассермана- Недостатня чутливість (в початковій стадії первинного сифілісу негативна). Вона також негативна у 1/3 хворих, якщо вони в минулому лікувалися антибіотиками, у пацієнтів третинним активним сифілісом з ураженнями шкіри та слизових, кістково-суглобового апарату, внутрішніх органів, центральної нервової системи, при пізньому вродженому сифілісі.
Недостатня специфічність- реакція Вассермана може бути позитивна в осіб, які раніше не хворіли і не хворіють на сифіліс. Зокрема хибнопозитивні (неспецифічні) результати РВ відзначаються у хворих, які страждають на системний червоний вовчак, лепру, малярію, злоякісні новоутворення, ураження печінки, великі інфаркти міокарда та інші захворювання, а іноді у абсолютно здорових людей.
Короткочасна хибно-позитивна реакція Вассермана виявляєтьсяу деяких жінок перед пологами або після них, у осіб, які зловживають наркотиками, після наркозу, алкоголю. Як правило, хибнопозитивна РВ виражена слабо, частіше з низьким титром реагінів (1:5-1:20), позитивна (3+) або слабко позитивна (2+). При масових серологічних обстеженнях частота хибно-позитивних результатів становить 0,1-0,15%. Для подолання недостатньої чутливості користуються постановкою на холоді (реакція Колляра) і одночасно вона ставиться з іншими серологічними реакціями.

Осадові реакції Кана та Закса-Вітебського

Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІБТ)

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА)

Техніка взяття крові для серологічних реакцій

Серологічна резистентність

• Справжня(Абсолютна, безумовна) - необхідно провести додаткове протисифілітичне лікування, комбінуючи з неспецифічною терапією для підвищення імунних сил організму.
• Відносна- після повноцінного лікування бліді трепонеми утворюють цист- або L-форми, які знаходяться в організмі в маловірулентному стані і внаслідок цього додаткове лікування не змінює показники серологічних реакцій, особливо РІФ та РІБТ.

Псевдорезистентність- після проведеного лікування, незважаючи на позитивні серологічні реакції, бліда трепонема в організмі відсутня. Антигену в організмі немає, але продовжується вироблення антитіл, які фіксуються при постановці серологічних реакцій.
Серологічна резистентність може розвиватися внаслідок:

• неповноцінного лікування без урахування давності та стадії захворювання;
• недостатня доза і зокрема через неврахування маси тіла пацієнтів;
• порушення інтервалу між запровадженням препаратів;
• збереження в організмі блідих трепонем незважаючи на проведене повноцінне специфічне лікування, через їх стійкість до пеніциліну та інших хіміопрепаратів у разі наявності прихованих, осумкованих вогнищ ураження у внутрішніх органах, нервовій системі, лімфатичних вузлах, які малодоступні для антибактеріальних препаратів. у тканинах рубця через багато років після закінчення терапії, у лімфатичних вузлах іноді вдається виявити бліді трепонеми через 3-5 років після протисифілітичної терапії);
• зниження захисних сил при різних захворюваннях та інтоксикаціях (ендокринопатії, алкоголізм, наркоманія та ін.);
• загального виснаження (прийом їжі бідної вітамінами, білками, жирами).

• супутніми неспецифічними захворюваннями внутрішніх органів, порушеннями серцево-судинної системи, ревматизмом, дисфункціями ендокринної та нервової систем, важкими хронічними дерматозами, злоякісними новоутвореннями;
• ураженнями нервової системи (важкі травми, струс головного мозку, психічні травми);
• вагітністю; хронічні інтоксикації алкоголем, нікотином наркотиками; інфекційними хворобами (малярія, туберкульоз, вірусний гепатит, дизентерія, висипний, черевний та зворотний тифи).

Нині широко застосовуються серологічні реакції (СР), у яких беруть участь мічені АГ чи АТ. До них відносяться реакція імунофлюоресценції, радіоімунний та імуноферментний методи, реакція імуноблотингу, проточна цитометрія та електронна мікроскопія.

Вони застосовуються:

1) для серодиагностики інфекційних захворювань, т. е. виявлення АТ з допомогою набору відомих кон'югованих (хімічно сполучених) з різними мітками (ферментами, флюорохромними барвниками), антигенів;

2) для визначення мікроорганізму або його серовару за допомогою стандартних мічених діагностичних антитіл (експрес-діагностика).

Готують діагностичні сироватки імунізацією тварин відповідним АГ, потім виділяють імуноглобуліни і кон'югують їх зі барвниками (флюорохромами), ферментами, радіоізотопами.

Діагностичних моноклональних антитіл одержують за допомогою гібридних клітин, утворених шляхом злиття імунного В-лімфоциту з мієломною клітиною. Гібридоми здатні швидко розмножуватися in vitro в культурі клітин і при цьому продукувати імуноглобулін, характерний для взятого В-лімфоциту.

Мічені СР за специфічністю не поступаються іншим СР, а за своєю чутливістю вони перевершують усі СР.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

Як мітки використовуються флюорохромні барвники, що світяться (ізотіоцінат флюоресцеїну та ін.).

Існують різні модифікації РІФ. Для експрес - діагностики інфекційних захворювань - для виявлення мікробів або їх антигенів у досліджуваному матеріалі застосовується РІФ Кунс.

Виділяють два методи РІФ за Кунсом: прямий і непрямий.

Компоненти прямої РІФ:

1) досліджуваний матеріал (випорожнення, що відокремлюється носоглотки та ін);

2) мічена специфічна імунна сироватка, що містить АТ до шуканого антигену;

3) ізотонічний розчин натрію хлориду.

Мазок з досліджуваного матеріалу обробляють міченою антисироваткою.

Відбувається реакція АГ-АТ. При люмінесцентному мікроскопічному дослідженні на тій ділянці, де локалізуються комплекси АГ-АТ, виявляють флюоресценцію мітки (рис.34).

Компоненти непрямий РІФ, призначений для експрес-діагностики грипу А:

1) досліджуваний матеріал змив із носоглотки хворого з підозрою на грип;

2) специфічна антисироватка з антитілами проти вірусу грипу А;

3) антиглобулінова сироватка (АТ проти імуноглобуліну), мічена флюорохромом;

4) ізотонічний розчин натрію хлориду.

Мазок з досліджуваного матеріалу спочатку обробляють імунною сироваткою до антигену, а потім - міченою антиглобулінової сироваткою.

Імунні комплекси АГ-АТ – мічені АТ виявляються за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Перевага непрямого методу полягає в тому, що немає необхідності приготування широкого набору флюоресцирующих специфічних сироваток, а застосовується лише одна антиглобулінова сироватка, що флюорескує.

Для серологічної діагностики грипу А,тобто для визначення антитіл проти вірусу грипу А у сироватці крові за допомогою непрямий РІФвикористовують грипозний діагностикум (антиген вірусу грипу А). Серодіагностика вірусних інфекцій здебільшого носить ретроспективний характер і застосовується для підтвердження діагнозу та епідеміологічного аналізу.

Імуноферментний аналіз (ІФА): конкуретний спосіб (визначення HBs-АГ вірусу гепатиту В) та непрямий спосіб (серологічна діагностика ВІЛ – інфекції)

Імуноферментний аналіз (ІФА)

Як мітки використовуються ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза та ін.

Індикатором реакції є здатність ферментів викликати кольорові реакції при дії відповідний субстрат. Наприклад, субстратом для пероксидази є розчин ортофенілдіаміну (ОФД) або тетраметилбензидин (ТМБ).

Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА (рис.35), непрямий та конкурентні способи (рис.36).

Результати ІФА можна оцінити візуально та вимірюванням оптичної щільності на спектрофотометрі (ІФА – аналізаторі).

До переваг ІФА слід віднести:

Простота методів оцінки реакції;

Стабільність кон'югатів;

Легко піддається автоматизації.

Як приклади наводяться такі типи ІФА:

а) конкурентний тип

Призначений для виявлення поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBs Ag) у сироватках та плазмі крові при діагностиці вірусного гепатиту В та визначення носійства HBs Ag.

Компоненти:

1) досліджуваний матеріал – сироватка чи плазма крові;

2) антитіла до HBs Ag, адсорбовані на поверхні лунки полістиролу мікропланшета;

3) кон'югат – мишачі моноклональні антитіла до HBs Ag, мічені пероксидазою;

4) ортофенілендіамін (ОФД) – субстрат;

5) фосфатно - сольовий буфер;

6) контрольні сироватки:

Позитивна (сироватка з HBs Ag);

Негативна (сироватка без HBs Ag).

Хід роботи:

2. Інкубація 1:00 при 37°С.

3. Відмивання лунок.

4. Внесення кон'югату.

5. Інкубація 1:00 при 37°С.

6. Відмивання лунок.

7. Внесення ОФД. За наявності HBs Ag розчин у лунках жовтіє.

8. Облік ІФА проводять за оптичною густиною за допомогою фотометра. Ступінь оптичної щільності буде обернено пропорційної концентрації досліджуваних HBs Ag.

Реакція протікає у три фази:

1. HBs Ag досліджуваної сироватки (плазми) зв'язується з гомологічними АТ, адсорбованими на поверхні лунки. Утворюється ІЧ АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитіла до HBs Ag, мічені пероксидазою зв'язуються з вільними детермінантоми HBs Ag комплексу АГ-АТ, що залишилися. Утворюється комплекс АТ-АГ-мічені АТ (anti HBs АТ – HBs Ag – anti HBs АТ, мічені пероксидазою).

3. ОФД взаємодіють з пероксидазою комплексу АТ-АГ-АТ та відбувається жовте фарбування.

В) непрямий тип

Є основною тестовою реакцією діагностики ВІЛ – інфекції.

Ціль: Серологічна діагностика ВІЛ-інфекції – виявлення антитіл до антигенів ВІЛ.

Компоненти:

1) досліджуваний матеріал - сироватка крові (АТ до АГ-м ВІЛ);

2) синтетичні пептиди, що імітують 2-х антигенів ВІЛ: gp 120 і gр 41, адсорбовані на поверхні полістиролової лунки;

3) антиглобулінова сироватка, мічена пероксидазою, отримана шляхом імунізації кроликів глобулінами людини (АТ до АТ);

5) фосфатно-сольовий буфер;

6) контрольні сироватки:

Позитивна;

Негативна.

Хід роботи:

1. Внесення контрольних та досліджуваних сироваток.

2. Інкубація 30 хвилин за 37°С.

3. Відмивання.

4. Внесення антиглобулінової сироватки міченою ферментом.

5. Інкубація 30 хвилин за 37°С.

6. Відмивання.

7. Внесення ОФД.

Реакція протікає у 3 фази:

1. Антитіла до ВІЛ досліджуваної сироватки зв'язуються з гомологічними антигенами (gр 120 та gр 41), і на поверхні сорбенту утворюється ІЧ АГ-АТ (АГ ВІЛ - АТ до ВІЛ).

2. Утворення ІЧ АГ-АТ-АТ, мічене пероксидазою, т.к. АТ досліджуваної сироватки є антигенами для антиглобулінової сироватки.

3. ОФД взаємодіє з пероксидазою комплексу АГ-АТ-АТ і відбувається жовте фарбування розчину лунки. Ступінь ферментативної активності прямо пропорційна концентрації досліджуваних АТ.

№35 Реакція імунофлюоресценції. Механізм, компоненти, застосування.
Імунофлюоресцентний метод (РІФ, реакція імунофлюоресценції, реакція Кунса) – метод виявлення специфічних АГ за допомогою АТ, кон'югованих з флюорохромом. Має високу чутливість і специфічність.
Застосовується для експрес-діагностики інфекційних захворювань (ідентифікація збудника в досліджуваному матеріалі), а також для визначення АТ та поверхневих рецепторів та маркерів лейкоцитів (імунофенотипування) та ін клітин.
Виявлення бактеріальних та вірусних антигенів в інфекційних матеріалах, тканинах тварин та культурах клітин за допомогою флюоресціюючих антитіл (сироваток) набуло широкого застосування в діагностичній практиці. Приготування флюоресцирующих сироваток засноване на здатності деяких флюорохромів (наприклад, ізотіоціанату флюоресцеїну) вступати в хімічний зв'язок із сироватковими білками,не порушуючи їх імунологічної специфічності.
Розрізняють три різновиди методу: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод РІФзаснований на тому, що антигени тканин або мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою люмінесцентною сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору.
Непрямий метод РІФполягає у виявленні комплексу антиген - антитіло за допомогою антиглобулінової (проти антитіла) сироватки, міченої флюорохромом. Для цього мазки із суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячої діагностичної сироватки. Потім антитіла, які не зв'язувалися антигенами мікробів, відмивають, а антитіла, що залишилися на мікробах, виявляють, обробляючи мазок антиглобулінової (антикроличої) сироваткою, міченою флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикролячі антитіла, мічені флюорохромом. Цей комплекс спостерігають у люмінесцентному мікроскопі, як і за прямого методу.
Механізм . На предметному склі готують мазок з досліджуваного матеріалу, фіксують на полум'ї та обробляють імунною кролячою сироваткою, що містить антитіла проти антигенів збудника. Для утворення комплексу антиген - антитіло препарат поміщають у вологу камеру та інкубують при 37 °Спротягом 15 хв, після чого ретельно промивають ізотонічним розчином хлориду натрію для видалення антитіл, що не зв'язалися з антигеном. Потім препарат наносять флюоресцирующую антиглобулінову сироватку проти глобулінів кролика, витримують протягом 15 хв при 37 °З, а потім препарат ретельно промивають ізотонічним розчином хлориду натрію. В результаті зв'язування флюоресцентної антиглобулінової сироватки з фіксованими на антигені специфічними антитілами утворюються комплекси, що світяться, антиген - антитіло, які виявляються при люмінесцентній мікроскопії.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ) – серологічна реакція, що дозволяє виявити антитіла до відомих антигенів. Метод полягає у мікроскопії пофарбованих мазків.

Дану реакцію використовують в імунології, вірусології та мікробіології. Вона дозволяє визначити наявність вірусів, бактерій, грибів, найпростіших та ІКК. РІФ дуже широко застосовується у діагностичній практиці для виявлення вірусних та бактеріальних антигенів в інфекційному матеріалі. Метод ґрунтується на здатності флюорохрому вступати у зв'язок з білками, не порушуючи при цьому їх імунологічної специфічності. В основному застосовується при діагностиці інфекцій сечостатевих шляхів.

Розрізняють такі методи проведення реакції імунофлюоресценції: прямий, непрямий, з комплементом. Прямий метод полягає у фарбуванні матеріалу флюорохромами. Завдяки здатності антигенів мікробів або тканин світитися в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа, вони визначаються як клітини з яскраво забарвленою облямівкою зеленого кольору.

Непрямий метод полягає у визначенні комплексу антиген+антитіло. Для цього дослідний матеріал обробляється антитілами антимікробної кролячої сироватки, призначеної для діагностики. Після того, як антитіла зв'яжуться з мікробами, їх відокремлюють від тих, що не зв'язалися, і обробляють антикролячою сироваткою, позначеною флюорохромом. Після цього комплекс мікроб+анімікробні антитіла+анітікроличі антитіла визначається за допомогою ультрафіолетового мікроскопа так само, як і при прямому методі.

Реакція імунофлюоресценції є незамінною при діагностиці сифілісу. Під впливом флюорохрому збудник сифілісу визначається як клітина із жовто-зеленою облямівкою. Відсутність свічення означає, що пацієнт не заражений сифілісом. Цей аналіз часто призначається за позитивної реакції Вассермана. Цей метод дуже ефективний при діагностиці, оскільки дозволяє визначити збудника на ранніх стадіях захворювання.

Крім того, що РІФ дозволяє діагностувати сифіліс, його також застосовують для визначення таких збудників як хламідії, мікоплазма, трихомонади, а також збудників гонореї та генітального герпесу.

Для проведення аналізу використовують мазки чи венозну кров. Процедура взяття мазка абсолютно безболісна і не становить жодної небезпеки. До здачі цього аналізу необхідно підготуватися. За дванадцять годин до нього не рекомендується користуватися засобами гігієни, такими як мало або гелі. Також іноді за показаннями лікаря проводитиметься провокація. Для цього рекомендують прийом гострої їжі або алкоголю або проводиться ін'єкція провокуючої речовини, наприклад, гоновакцину або пірогенал. Крім цього, проміжок між прийомом антибактеріальних препаратів і здаванням аналізу повинен бути не менше чотирнадцяти днів.

Оцінюючи результатів слід враховувати те що, що світіння спостерігається у живих бактерій, а й у мертвих, особливо це стосується хламідій. Після курсу антибіотиків мертві клітини хламідій також мають свічення.

При правильній підготовці пацієнта та дотриманні техніки взяття мазка даний аналіз дозволяє визначити захворювання на ранніх стадіях, що дуже важливо для своєчасного лікування. Позитивними сторонами даного методу є короткі терміни одержання результату, простота виконання та невелика вартість аналізу.

До недоліків можна віднести те, що для проведення аналізу необхідно досить багато досліджуваного матеріалу. Крім того, оцінку результатів може проводити лише досвідчений фахівець.