Белки теплового шока новые исследования. Влияние теплового шока на клеточном уровне

В 1962 году в Италии молодой генетик Ферруччио Ритосса обнаружил набухание (puffing) некоторых участков хромосом дрозофилы при случайном повышении температуры в термостате. Это оказалось проявлением активации генов и получило название "ответа на тепловой шок" (heat shock response) (ссылка ), а индуцируемые белки были названы белками теплового шока, БТШ (heat shock proteins , HSP ). В дальнейшем этот класс белков был найден во всех клетках всех живых организмов - от бактерий до человека. Известно, что подобный ответ проявляется, кроме тепловых, при различных биологических (инфекция, воспаление), физических (радиация, гипоксия), химических (спирты, металлы) и других стрессорных воздействиях . Поэтому белки теплового шока называют также белками стресса . Повышенная экспрессия белков HSP защищает клетку, стабилизируя денатурированные или неправильно свернутые пептиды. Накапливаясь при различных вредных воздействиях, белки теплового шока помогают клетке поддерживать гомеостаз в условиях стресса (см). Белки HSP реагируют не только на внешние стрессовые ситуации, они проявляются при многих болезнях, как, например, нейродегенерация, метаболические нарушения, ишемические повреждения и рак, что определяет повышенный интерес к этим белкам и поиску терапевтичеких инструментов, регулирующих их реакции (2006 , 2007 , 2007а ).
Белки теплового шока служат биологическими маркерами неблагоприятного состояния организма .

Ответ клетки на стресс регулируется, прежде всего, на уровне транскрипции (ДНК в РНК) с помощью факторов теплового шока (heat shock factor, HSF ) (). Семейство HSF содержит 4 вида, из которых у млекопитающих и человека экспрессируются HSF1, HSF2 и HSF4, причем HSF1 является универсальным стресс-реагирующим активатором, в то время как HSF2 больше связан с процессами дифференцировки. В отсутствие стресса эти факторы находятся в ядре и цитоплазме в мономерной форме и не способны связываться с ДНК. В ответ на стресс HSF образуют тримеры (возможны гомотримеры HSF1 либо гетеротримеры HSF1-HSF2) (см .) и перемещаются в ядро, где они связываются с элементами теплового шока (HSE ) - специфическими последовательностями ДНК в промоторах генов теплового шока.

Последующее фосфорилирование тримеров HSF сопровождается активацией транскрипции генов теплового шока и повышением уровня HSP, приводя к образованию комплексов HSF-HSP . Когда стресс прекращается, тримерные формы HSF отделяются от ДНК, превращаясь опять в неактивные мономеры, а клетка возвращается к нормальному белковому синтезу (ссылка).
Предполагается, что белки теплового шока сами могут регулировать экспрессию своих генов через "петлю авторегуляции". Согласно этой гипотезе, увеличение концентрации неправильно свернутых белков, возникшее при стрессе, приводит к связыванию специфических HSP и активации HSF.

Белки теплового шока как молекулярные шапероны

Дальнейшее изучение класса HSP показало, что эти белки не только индуцируются при стрессе, но многие из них функционируют конститутивно как молекулярные шапероны , участвуя в стабилизации и перемещении незрелых пептидов при нормальном росте. Например, белки Hsp70, Hsp90 присутствуют в высоких концентрациях в не-стрессовых клетках, составляя 1-1,5% общего клеточного белка, что указывает на постоянную потребность клетки в поддержании конформационного гомеостаза ее белков . Эти белки находятся в цитозоле, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и ядре. Молекулярные массы HSP лежат в пределах 15-110 кДа. Наиболее изученными у млекопитающих являются белки HSP 60, 70, 90 и 110 кДа, которые играют важную роль в фундаментальных внутриклеточных процессах - от антиапоптозного действия до разворачивания и внутриклеточного перемещения белков .
Функции БТШ как шаперонов можно свести к следующим:
1. Свертывание незрелых полипептидных цепей;
2. Облегчение перемещения белков через разные клеточные компартменты;
3. Модуляция белковой активности за счет стабилизации и/или созревания до функционально компетентной конформации;
4. Поддержка образования/расщепления мультибелковых комплексов ;
5. Исправление неправильно свернутых белков;
6. Защита белков от агрегации ;
7. Направление полностью поврежденных белков к расщеплению ;
8. Организация агрегатов из разрушенных белков;
9. Солюбилизация белковых агрегатов для дальнейшей деградации.

Ко-шапероны

Активность белков теплового шока регулируется другими белками - ко-шаперонами , которые способствуют выполнению основных функций HSP. Хотя многие ко-шапероны являются растворимыми цитозольными белками, некоторые из них локализованы во внутриклеточных мембранах или элементах цитоскелета. Эти специализированные ко-шапероны включают ауксилин, Tom70, UNC-45, гомологи Bag-1. Ко-шапероны могут участвовать в АТФ-зависимой активности HSP70 и HSP90, включая такие функции, как секреция, белковый транспорт и образование/расщепление белковых комплексов (ссылка).
Ко-шапероны Hip, Hop, Hup, CHIP модулируют нуклеотидный обмен и связывание субстратов белками HSP70, координируя свертывание новосинтезированных белков, исправляют неправильное свертывание поврежденных и денатурированных белков, направляют перенос белков через клеточные мембраны, ингибируют агрегацию белков и осуществляют деградацию по протеасомальному пути () .

Функции некоторых ко-шаперонов

Белки HSP70 вместе с ко-шарепонами осуществляют, по меньшей мере, 2 альтернативных вида активности : предотвращают агрегацию не-нативных белков при связывании с гидрофобными участками молекул субстратов, защищая их от межмолекулярных взаимодействий ("охранная", "holder" активность ), а также способствуют свертыванию не-нативных интермедиатов до нативного состояния ("свертывающая", "folder" активность ).

HSP и АТФ-азный цикл

Белки теплового шока у млекопитающих представлены 6 семействами в зависимости от молекулярной массы: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 и малые Hsps (15 to 30 kDa), включающие Hsp27. Высокомолекулярные HSP являются АТФ-зависимыми, а активность малых HSP не зависит от АТФ.
Генетические и биохимические данные показали, что гидролиз АТФ является существенным элементом активности шаперонов HSP70. Белки этого семейства связываются с промежуточными пептидами за счет циклов связывания и гидролиза АТФ, а последующий обмен АДФ/АТФ сопровождается освобождением пептидов. Молекулы HSP70 содержат две консервативных области - N-концевую АТФ-связывающую (45 кДа) и С-концевую (15 кДа), связывающую гидрофобные пептиды . Между ними находится более вариабельная область альфа-спиральной "крышки". АТФ-связанный HSP70 ("крышка" открыта) свободно взаимодействует с незрелыми или неправильно свернутыми пептидами, вызывая конформационные изменения, которые приводят к активации АТФ-азы и усиливают ассоциацию с ко-шапероном HSP40, что способствует переходу к АДФ-связанной ("крышка" закрыта) форме. Для эффективного сопряжения гидролиза АТФ со связыванием и последующим освобождением пептидных субстратов существенны ко-шапероны семейства JDP (J-domain proteins) ( ; ).

Белки теплового шока при ишемии

Цитопротекторные свойства белков класса HSP70 были показаны на различных моделях ишемических нарушений in vitro и in vivo ( , , , , , ). Вначале эта защита объяснялась действием HSP как шаперонов (поддержанием правильного свертывания белков и предотвращением их агрегации), но затем выяснилось, что HSP70 могут напрямую реагировать с путями клеточной смерти - апоптозом и некрозом .
Как видно из рисунка, церебральная ишемия индуцирует апоптоз разными способами, а HSP70 уменьшает действие их всех. "Внутренний" путь апоптоза состоит в выделении про-апоптозных митохондриальных веществ, открытии митохондриальной поры и активации каспаз (см .). Другой ("внешний") путь связан с активацией рецепторов плазматической мембраны (Fas и TNFR), индуцирующих апоптоз через каспазу-8, используя фактор TRAF. Кроме того, известны механизмы каспаз-независимого апоптоза (см .).
БелкиHSP70 могут ингибировать освобождение цитохрома с (cyt c) из митохондрий и транслокацию индуцирующего апоптоз фактора AIF в ядро, уменьшая ишемическое повреждение мозга (см .), а также ингибировать освобождение проапоптозного белка Smac/DIABLO из митохондрий миоцитов .
Экспрессия HSP72 в астроцитах приводит к снижению образования реактивных видов кислорода (ROS) и поддержанию мембранного потенциала митохондрий , а также уровня глутатиона и увеличению активности супероксиддисмутазы при ишемических нарушениях в кардиоцитах.
Повышенная экспрессия HSP72 способна уменьшать апоптоз прямо через увеличение уровня Bcl-2 и с помощью ингибирования транслокации проапоптозного фактора Bax.
Показано, что белки класса HSP70 ингибируют дефосфорилирование киназы JNK (c-Jun N-terminal kinase), которая играет существенную роль в нейрональном апоптозе и является одной из мишеней для терапии инсультов.
Кроме того, белки Hsp взаимодействуют с топоизомеразой 1 (регулятором апоптоза) и являются эффекторами важной антиапоптозной киназы Akt/PKB (см). Значительная активация белками теплового шока глутатион-пероксидазы и глутатионредуктазы является существенным элементом в механизме цитопротекторного действия HSP при ишемии ().

Противовоспалительный эффект белков теплового шока

Белки теплового шока оказывают выраженное противовоспалительное действие, предотвращая ответы клеток на такие воспалительные цитокины , как TNF и IL-1 .
Известно, что при воспалении образуются ROS за счет активации индуцируемой формы NO-синтазы (iNOS) и NADPH-оксидазы, причем iNOS возникает в ответ на выделение цитокинов. Синтезируемая iNOS закись азота (NO) реагирует с супероксидом, образуя высокотоксичный окислитель пероксинитрит: -O2− + -NO → ONOO−
а HSP72 ингибирует экспрессиюiNOS, уменьшая активацию NFkappaB (ссылка). Кроме того, белки теплового шока снижают активность NADPH-оксидазы в нейтрофилах и активируют супероксиддисмутазу в фагоцитах , а также регулируют активность матричных металлопротеиназ в астроцитах .
Значительная часть внутриклеточных эффектов белков HSP при воспалении связана с регуляцией ими пути ядерного фактора NFκB, так как факторы транскрипции этого семейства являются ключевыми участниками запуска воспалительной реакции. Транслокация димеров, составляющих NFkB, в ядро, где они индуцируют экспрессию многих воспалительных генов, ингибируется белками теплового шока за счет прямого взаимодействия либо через влияние на сигнальные пути NFkB.
Показано также, что Hsp72 взаимодействует с киназным комплексом IKK, необходимым для освобождения NFkB и перехода его в ядро .
Таким образом, белки класса HSP70 используют много путей для предотвращения воспалительных процессов в организме (обзор).

Внеклеточное действие белков теплового шока

Белки HSP долгое время считали цитоплазматическими, функции которых ограничены внутриклеточным компартментом. Однако в последнее время возрастает число наблюдений о том, что эти белки могут выделяться во внеклеточную среду и оказывать действие на другие клетки . Впервые это было показано на глиальных клетках гигантского аксона кальмара, освободившиеся из которых белки HSP70 переходили внутрь аксона . Работами нескольких лабораторий исследовано влияние выделенных из астроцитов или шванновских клеток HSP72 на соседние нейроны и аксоны. Внеклеточные эффекты HSP получены также на клетках эпителия , эмбриональных клетках крысы , В-лимфоцитах , дендритных и опухолевых клетках .
Показано, что внеклеточный HSP72 может индуцировать выделение цитокинов (TNF, IL-6, IL-1beta) из моноцитов, что обеспечивается рецепторами TLR2, TLR4 и активацией NFkB .
Внеклеточные HSP могут взаимодействовать с липидами клеточных мембран и встраиваться в мембраны, образуя АТФ-зависимые катионные каналы (см .). Кроме того, HSP72, взаимодействуя с фосфатидилсерином на поверхности апоптозных клеток, ускоряет гибель этих клеток .
Наблюдается значительная корреляция между повышенным уровнем сывороточного HSP70 и снижением развития атеросклероза, определяемого по толщине интимы сонной артерии ().
Терапевтическое значение может иметь также тот факт, что у больных с коронарной недостаточностью наблюдается обратная корреляция между уровнем HSP70 в сыворотке крови и степенью риска этого заболевания , показанной ангиограммой коронарной артерии (см .).

Роль белков теплового шока в иммунных реакциях

HSP и противораковая терапия

Белки теплового шока высоко экспрессируются при многих видах рака у человека и участвуют в пролиферации, дифференциации, метастазировании и узнавании опухолевых клеток иммунной системой. Они являются полезными биомаркерами канцерогенеза в некоторых тканях и сигнализируют о степени дифференциации и агрессивности некоторых видов рака . Кроме того, уровень циркулирующих HSP и анти-HSP антител может быть полезным для диагностики рака . Повышенная экспрессия HSP может также иногда предсказывать ответ на противораковое лечение . Например, HSP27 и HSP70 причастны к сопротивлению химиотерапии при раке груди, повышение уровня HSP27 предсказывает плохую реакцию на химиотерапию при лейкемии. В то же время экспрессия HSP70 предполагает хорошие химиотерапевтические эффекты при остеосаркомах (см. обзор ).
В развитии противораковой терапии с участием HSP сыграла роль их двойная функция в организме : с одной стороны - внутриклеточная цитозащитная/анти-апоптозная , а с другой - внеклеточная/иммуногенная .
Это позволило разработать 2 основные стратегии в противораковой терапии :
1) Фармакологическая модификация экспрессии HSP и их активности в качестве молекулярных шаперонов;
2) Применение HSP в противораковых вакцинах на основании их способности действовать в качестве иммунологических адъювантов .

Наиболее перспективным в качестве антиканцерной фармакологической мишени оказался белок HSP90. Его уровень составляет 1-2% от общего содержания белков в отсутствие стресса, а количество его белков-клиентов превышает 100, многие из которых связаны с онкогенезом. Повышенная экспрессия HSP90 обнаружена при опухолях груди, раке легких, лейкемиях, болезни Ходжкина, лимфомах и других онкологических заболеваниях . Поэтому ингибирование HSP90 может разрушать одновременно большое количество онкогеных сигнальных путей. Разработкой ингибиторов HSP90 занимается множество лабораторий ( , , 2007а , 2007b и др.).

Естественные ингибиторы HSP90 - гелданамицин (GA) и 17-аллиламино-17-деметоксигелданамицин (17-AAG) - взаимодействуют с АТФ-связывающим участком молекулы HSP90 с более высоким сродством, чем натуральные нуклеотиды, и препятствуют АТФ-АДФ переходам белка, нарушая активность HSP90 как шаперона, а его белки-клиенты деградируются протеасомой. Существенно, что ингибиторы HSP90, удаляя белки-клиенты в раковых клетках, не влияют на те же белки в нормальных тканях, так как их сродство к HSP90, выделенному из опухолей, в 20-200 раз выше (см .).
Подробно об естественных и искусственных ингибиторах белков теплового шока и механизмах их действия можно прочитать в обзорах , .

Способность белков теплового шока связывать пептиды-антигены легла в основу иммунотерапевтического подхода к лечению онкозаболеваний. Выделенные из опухолей онкологических больных пептидные комплексы Hsp70 и Grp96 используются в качестве антираковых вакцин для лечения и предупреждения рака. Белки теплового шока, кроме проявления шапероновой активности к опухолевым пептидным антигенам, облегчают вхождение в клетки HSP-пептидных комплексов за счет рецепторного эндоцитоза. Это позволило достаточно быстро перенести основанные на HSP вакцины от изучения на моделях животных к лечению раковых заболеваний в клинике. Улучшенные формы HSP-вакцин получаются при выделении HSP70-пептидных комплексов из дендритных клеток, слившихся с опухолевыми .

Прамод К. Сривастава (Pramod K. Srivastava, a professor of medicine and director of the Center for Immunotherapy of Cancer and Infectious Diseases at the University of Connecticut School of Medicine) - один из первых исследователей роли белков теплового шока в иммунной системе. С его участием создана компания Antigenics, успешно разрабатывающая противораковые вакцины на основе HSP, выделенных из индивидуальных опухолей пациентов .

Эти препараты, основанные на различных белках теплового шока, в настоящее время проходят клинические испытания.

Белки теплового шока при старении

По мере старения организмы утрачивают способность адекватно реагировать на внешние стрессы и поддерживать гомеостаз . Старые клетки более подвержены нарушениям и болезням, поэтому с возрастом растет восприимчивость к этим факторам.
В течение жизни стабильного белка в нем возникают различные посттрансляционные изменения. Стабильность белков нарушается за счет многочисленных вредных воздействий - окисления боковых цепей, гликации, дезаминирования аспарагиниловых и глутаминиловых остатков, что приводит к образованию изопептидных связей. Чувствительность к протеотоксичным повреждениям возрастает из-за ошибок в транскрипции и трансляции и проявляется дефектами свертывания белков . Для старения характерен рост модификаций белка, связанных с гомеостазом свертывания (см. ) . Функции шаперонов нарушаются, увеличивается потребность в деградации белков, но активность главного протеолитического аппарата, протеасомы, также снижается с возрастом , приводя к опасности гликации. Агрегация также сопровождается ингибированием протеасом и остановкой клеточного цикла. С возрастом нарушается и лизосомальная деградация белков (возможно, за счет подавления липофусцином). Накопление неправильно свернутых белков и ослабление защитных механизмов приводит к

Александр Сапожников не согласен с таким теоретическим обоснованием механизма действия лекарства. По его словам, HSP70 может работать по другой схеме, которую только предстоит изучить, однако факт остается фактом - на клеточных культурах и ряде опухолей в двух линиях крыс, которым были привиты «человеческие» опухолевые клетки, белок действительно показывает активность.

По словам авторов работы, температура, при которой работают с HSP70 на культурах клеток, составляет 43°C, и она слишком высока для живых организмов, однако там, судя по всему, включаются иные механизмы, которые также только предстоит понять. Это касается и действия экзогенного неклеточного белка теплового шока внутри организма. «У каждого из нас в кровотоке присутствует достаточно высокий уровень HSP70 - до 900 нанограммов на миллилитр. Мы вводили его в животное и пытались смотреть, что с белком происходит дальше. В течение 40 минут мы видели следы HSP70 в крови, а потом он пропал. Есть мнение, что белок распадается, но мы так не думаем».

Впечатляющие результаты в ожидании проверки

Ирина Гужова рассказала и о дальнейших испытаниях препарата: «Мы испытывали этот механизм на мышиной меланоме B16, которая растет подкожно, и использовали в виде геля, наносимого на поверхность кожи. Результат получился впечатляющий: выживаемость мышей была гораздо выше, чем у контрольной группы, которую лечили гелем без действующего вещества или не лечили вообще. Разница была примерно в десять дней. Для мышей и данного типа опухоли это очень хорошая отсрочка. Подобные результаты были показаны и на крысиной глиоме C6 (это опухоль, которая растет непосредственно в мозге).

Животные, которых лечили однократной инъекцией в мозг, получали дополнительно десять дней жизни, а животные, которым вводили белок постоянно в течение трех дней с помощью помпы, эта продолжительность увеличивалась еще на десять дней, так как опухоль росла медленнее. Мы показали, что если обеднить популяцию Т-лимфоцитов от мыши, которая имела опухоль, и убрать уже «наученные» NK-клетки или CD8-положительные лимфоциты, то они не будут узнавать опухоль так хорошо. Можно сделать вывод, что основная функция HSP70 в этом процессе - активация специфического иммунитета».

Эти данные побудили ученых провести ограниченное исследование в рамках клиники имени Поленова (НИИ Нейрохирургии в Санкт-Петербурге). «В это время в нашем коллективе был нейрохирург Максим Шевцов, который одновременно с аспирантурой Бориса Александровича (Маргулиса, - прим. сайт) проходил ординатуру в этом НИИ. Он убедил своего руководителя, профессора Хачатуряна, испытать этот препарат. По тогдашнему законодательству достаточно было решения ученого совета и информированного согласия пациентов, и нам было выделено 25 больных. У них у всех были различные опухоли мозга, и они все получали то, что им полагалось по страховке, но плюс после хирургического удаления опухоли Максим вводил в операционное ложе раствор HSP70.

Проблема в том, что опухоли мозга удалить полностью сложно. Всегда остаются маленькие кусочки, которые опасно удалять, потому что вместе с ними можно удалить личность, и эти кусочки дают рецидивы. Но результаты оказались совершенно потрясающими: после операции у больных увеличивалось количество клеток специфического иммунитета, понижалось количество проопухолевых («перешедших на сторону опухоли») Т-лимфоцитов и уменьшалось количество интерлейкина-10 (информационной молекулы иммунной системы).

Исследование было только пилотное, не рандомизированное, группы контроля тоже не было, и проводилось оно в 2011 году. В том же году был принят закон, согласно которому такие испытания запрещены, и их пришлось прекратить, едва начав. У нас осталось 12 прооперированных пациентов. Кто знаком с клинической частью исследований, тот имеет представление о том, насколько сложно отследить судьбы пациентов после того, как каждый из них покидает клинику. Поэтому мы знаем только о восьми, которые остались доступны для контакта, и все они живы до сих пор. На начало осени прошлого года они были вполне здоровы, и те, кто продолжал учиться, осенью пошли в школу, хотя средний прогноз продолжительности жизни с обнаруженной глиомой - 14 месяцев».

Сейчас, по словам докладчиков, доклинические испытания подходят к концу, и препарату необходима многоступенчатая проверка на пациентах, которая займет несколько лет (вот почему в статье «Известий» фигурировал такой неправдоподобно короткий срок до выхода препарата на рынок - 3-4 года).

Александр Сапожников также подчеркнул важность клинических испытаний: «Привитая мышам опухоль и человеческая - это небо и земля. Препарат может работать на этой опухоли, но быть неэффективным ни на обычной опухоли мыши, ни на человеческой. Успокойте своих коллег, лекарства от всех болезней сразу не бывает».

Так считают и сами исследователи. «На данных стадиях все работает (и очень хорошо), но, конечно же, это не то лекарство, которое поднимает Лазаря, - заявляет Ирина Гужова, - однако оно достаточно эффективно и достойно того, чтобы пройти клинические испытания. И мы надеемся, что это случится».

Просто космос

У читателя может возникнуть резонный вопрос: откуда вообще взялся космос? Ирина Гужова поясняет: «Дело в том, что испытания проходили на базе Института особо чистых препаратов, у сотрудников которого хороший опыт в регистрации патентов и написании бумаг, поэтому мы это дело отдали им. Одновременно они начали производство этого белка, а мы делали опыты на животных. Но в процессе к ним обратился представитель Роскосмоса и спросил, а нет ли у нас какого-то незакристаллизованного белка, чтобы закристаллизовать в космосе, на орбите. И им отдали HSP70, кристаллы пытались вырастить на орбите, но ничего не получилось».

Проблема оказалась в строении белка. Очень подвижная часть в структуре белка мешала кристаллизации, поэтому его стали пытаться закристаллизовать по кусочкам, связывать подвижную часть специальной молекулой, чтобы она его «держала». Пытаются до сих пор. «Отсюда выросла эта история про клетки, которые растут в космосе и лечат всех от рака», - комментирует Ирина Гужова.

Она также сообщила, что для испытаний в космосе и на мышах белок подвергли очень высокой степени очистки - около 99%. Что касается сомнений, что активирует иммунитет не шаперон, а липополисахарид (ЛПС) - компонент клеточной стенки бактерий, в которых нарабатывают этот белок, - такая вероятность невелика. Хотя ЛПС «прилипает» к HSP очень сильно, и очистить от самых мизерных его примесей белок довольно трудно. Ученые ставят дополнительные контроли, чтобы показать, что не он, а именно шаперон - причина эффекта препарата. Например, препарат могут кипятить, что не влияет на ЛПС, но разрушает структуру белка. Тогда его свойства HSP теряются, и препарат перестает работать, чего бы не произошло, если бы в нем действовал в основном бактериальный ЛПС.

Кроме того, исследователи сравнивали эффект введения компонентов клеточной стенки бактерий с эффектом от HSP70, и эти сравнения явно были в пользу последнего.

«Не говорили глупостей. И чего? – Ноль эмоций!»

Ирина сообщает, что побочных реакций в ходе испытаний ученые пока не обнаружили, но они могут быть отсроченными. «Я считаю, что исследователь в первую очередь должен на себе все попробовать сам, и прошла два курса шаперонотерапии. Никаких побочных эффектов не было, наоборот, казалось, что проходят мелкие болячки и крылья вырастают за спиной».

«С другой стороны, все, что было в СМИ, - настоящее безобразие, - отмечает исследователь. - Но, как говорится, не было бы счастья, да несчастье помогло: уже сейчас в Институт особо чистых препаратов поступают звонки с предложениями помочь с клиническими испытаниями. Мы выступали на конференциях и в разных более скромных СМИ, говорили о том же самом, но выверяли слова, не говорили глупостей. И чего? - Ноль эмоций! А тут пронеслась такая вот муть по экранам, и пожалуйста! Такое интересное общество, такая интересная страна».

Впрочем, согласно источникам сайт, интервью, с которого все началось, Симбирцев дал вынужденно. предложили дать интервью, чтобы стимулировать интерес к проблемам Института и привлечь дополнительное финансирование на клинические испытания. Кроме того, ходят слухи о возможной утрате институтом юридического лица вследствие происходящих по всей стране слияний научных организаций. Видимо, ученый оказался не готов подробно и популярно рассказать газете о происходящем. «В этот раз все, что могло быть понято неправильно, было понято неправильно», - замечает источник.

В результате ситуация все больше становится похожа на небезызвестную басню, когда Роскосмос и госструктуры, раздающие гранты, рвутся в облака, ожидая немедленных результатов от фундаментальной науки, рак пятится назад, журналисты разливают структурированную воду… А российская наука в очередной раз оказывается в незавидном положении, вынужденная оправдываться за преступления, которых не совершала.

Все живые клетки отвечают на повышение температуры и некоторые другие стрессовые воздействия синтезом специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). К БТШ относят белки, синтезируемые клетками в ответ на тепловой шок, когда подавлена экспрессия основного пула белков, участвующих в нормальном метаболизме. Семейство 70 кДа БТШ (БТШ-70 эукариот и DnaK прокариот) объединяет белки теплового шока, играющие существенную роль как в обеспечении выживания клетки в стрессовых условиях, так и в нормальном метаболизме. Уровень гомологии между белками прокариот и эукариот превышает 50% при полной идентичности отдельных доменов. 70 кДа БТШ являются одной из самых консервативных групп белков в природе (Lindquist Craig, 1988 ; Yura et al., 1993), что связано, вероятно, с шаперонными функциями, которые эти БТШ выполняют в клетках

Индукция генов белков теплового шока (HSP) у эукариот происходит под воздействием фактора теплового шока HSF. В клетках, не подвергшихся стрессу, HSF присутствует и в цитоплазме и в ядре в виде мономерной формы, связанной с Hsp70 , и не имеет ДНК- связывающей активности. В ответ на тепловой шок или другой стресс, Hsp70 отсоединяется от HSF и начинает укладывать денатурированные белки. HSF собирается в тримеры, у него появляется ДНК связывающая активность, он аккумулируется в ядре и связывается с промотором. При этом транскрипция шаперонов в клетке возрастает во много раз. После того, как стресс прошел, освободившийся Hsp70 опять присоединяется к HSF, который при этом теряет ДНК-связывающую активность и все возвращается в нормальное состояние [ Morimoto ea 1993 ].Белки теплового шока появляются на поверхности клеток синовиальной оболочки при бактериальных инфекциях.

Большинство этих белков теплового шока образуются и в ответ на другие повреждающие воздействия. Возможно именно они помогают клетке пережить стрессовые ситуации. Существует три основных семейства белков теплового шока: с мол. массой 25, 70 и 90 кДа (hsp25 , hsp70 и hsp90 . В нормальных клетках было обнаружено множество очень похожих между собой белков из каждого семейства.Белки теплового шока помогают переводить в раствор и вновь сворачивать денатурированные или неправильно свернутые белки. Есть у них и другие функции.

Лучше всего изучены белки семейства hsp70 . Эти белки связываются с некоторыми другими белками, а также аномальными белковыми комплексами и агрегатами, от которых потом освобождаются, присоединяя AТР. Они помогают переводить в раствор и заново сворачивать агрегированные или неправильно свернутые белки путем нескольких циклов присоединения и гидролиза AТР. Аномальные белки имеются в любой клетке, но при некоторых воздействиях, например при тепловом шоке, их количество в клетке резко возрастает, и соответственно возникает необходимость в большом количестве белков теплового шока. Оно обеспечивается активацией транскрипции определенных генов теплового шока.

Белки теплового шока (Hsp - heat shock protein), образуя комплекс с растущей полипептидной цепью, предотвращают их неспецифическую агрегацию и деградацию под действием внутриклеточных протеиназ, способствуя их правильному фолдингу, происходящему с участием других шаперонов. Hsp70 принимает участие в ATP-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.

см. также ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ: КЛАСС: ТФ 3.4 факторы теплового шока - http://humbio.ru/humbio/transcription/0002df25.htm

Все живые клетки отвечают на повышение температуры и некоторые другие стрессовые воздействия синтезом специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ, Hsp, heat shock protein, stress protein) . У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН и др.), проявляющаяся в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Такие белки получили название белков теплового шока, а само явление - синдром теплового шока. Стрессовое воздействие на бактериальную клетку вызывает ингибирование синтеза обычных белков, но индуцирует синтез небольшой группы белков, функция которых предположительно заключается в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоидов и мембран. Еще не ясны те регуляторные механизмы, которые запускаются в клетке при воздействиях, вызывающих синдром теплового шока, но очевидно, что это универсальный механизм неспецифических адаптивных модификаций.

Как уже было сказано, к БТШ относят белки, синтезируемые клетками в ответ на тепловой шок, когда подавлена экспрессия основного пула белков, участвующих в нормальном метаболизме. Семейство 70 кДа БТШ ( БТШ-70 эукариот и DnaK прокариот) объединяет белки теплового шока, играющие существенную роль как в обеспечении выживания клетки в стрессовых условиях, так и в нормальном метаболизме. Уровень гомологии между белками прокариот и эукариот превышает 50% при полной идентичности отдельных доменов. 70 кДа БТШ являются одной из самых консервативных групп белков в природе ( Lindquist Craig, 1988 ; Yura et al., 1993), что связано, вероятно, с шаперонными функциями , которые эти БТШ выполняют в клетках

Индукция генов белков теплового шока (HSP) у эукариот происходит под воздействием фактора теплового шока HSF . В клетках, не подвергшихся стрессу, HSF присутствует и в цитоплазме и в ядре в виде мономерной формы, связанной с Hsp70 , и не имеет ДНК-связывающей активности. В ответ на тепловой шок или другой стресс, Hsp70 отсоединяется от HSF и начинает укладывать денатурированные белки. HSF собирается в тримеры, у него появляется ДНК связывающая активность, он аккумулируется в ядре и связывается с промотором. При этом транскрипция шаперонов в клетке возрастает во много раз. После того, как стресс прошел, освободившийся Hsp70 опять присоединяется к HSF, который при этом теряет ДНК-связывающую активность и все возвращается в нормальное состояние [ Morimoto ea 1993 ].Белки теплового шока появляются на поверхности клеток синовиальной оболочки при бактериальных инфекциях .

Большинство этих белков теплового шока образуются в ответ и на другие повреждающие воздействия. Возможно именно они помогают клетке пережить стрессовые ситуации. Существует три основных семейства белков теплового шока - семейства белков с мол. массой 25, 70 и 90 кДа ( hsp25 , hsp70 и hsp90 . В нормальных клетках было обнаружено множество очень похожих между собой белков из каждого из этих семейств. Они помогают переводить в раствор и вновь сворачивать денатурированные или неправильно свернутые белки. Есть у них и другие функции.

Лучше всего изучены белки семейства hsp70 . Эти белки связываются с некоторыми другими белками, а также аномальными белковыми комплексами и агрегатами, от которых потом освобождаются, присоединяя AТР. Они помогают переводить в раствор и заново сворачивать агрегированные или неправильно свернутые белки путем нескольких циклов присоединения и гидролиза AТР. Аномальные белки имеются в любой клетке, но при некоторых воздействиях, например при тепловом шоке, их количество в клетке резко возрастает, и, соответственно, возникает необходимость в большом количестве белков теплового шока. Что обеспечивается активацией транскрипции определенных генов теплового шока .

Белки теплового шока, образуя комплекс с растущей полипептидной цепью, предотвращают ее неспецифическую агрегацию и деградацию от действия внутриклеточных протеиназ, способствуя правильному фолдингу блков, происходящему с участием других шаперонов. Hsp70 принимает участие в ATP-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.

Белки теплового шока кодируются семейством эволюционно устойчивых генов, которые экспрессируются в ответ на разнообразные стрессовые воздействия и участвуют в механизмах адаптации. Впервые открытые при термическом шоке у дрозофиллы, стресс-белки участвуют в большинстве физиологических процессов всех живых организмов и являются компонентом единого сигнального механизма [ Ananthan J., Goldberg A.L. 1986 , Massa S.M., Swanson R.A. 1996 , Morimoto R., Tissieres A. 1994 , Ritossa F. 1962 ].

Активация транскрипционных факторов стресс-белков (HSF) происходит путем их фосфорилирования под влиянием увеличения внутриклеточной концентрации кальция, свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов и других процессов оксидантного стресса , активации протеазных ингибиторов и тирозинкиназ. Но основным триггером , запускающим синтез стресс-белков, является дефицит ATP , сопровождающий недостаточное поступление в ткань мозга кислорода и глюкозы [ Benjamin I. J., Hone S. 1992 , Bruce J.L., Price B.D. 1993 , Cajone F., Salina M. 1989 , Courgeon A.-M., Rollet E. 1988 , Freeman M.L., Borrelli M.J. 1995 , Kil H.Y., Zhang J. 1996 , Suga S., Novak T.S., Jr. 1998 , Price B.D., Calderwood S.K. 1991 , Zhou M., Wu X. 1996 ].

Существуют несколько классов транскрипционных факторов стресс- белков, среди которых белок HSF1 является медиатором ответа на стресс, a белок HSF2 - регулятором hsp-генов . В условиях церебральной ишемии HSF1 и HSF2 синергично активируют генную транскрипцию. Они образуют активированные тримеры, которые связываются с регуляторными последовательностями (HSE) в промоторных зонах стресс-генов, что приводит к синтезу мРНК. Накопление стресс-белков ведет к "включению" ауторегуляторной петли, прерывающей их дальнейшую экспрессию [ Baler R., Zou J. 1996 , Mestril R., Ch, S.-H. 1994 , Sistonen L, Sarge K.D. 1994 , Rabindran S.K., Haroun R.I. 1993 , Sarge K.D., Murphy S. 1993 , Sorger P.K., Pelham H.R.B. 1987 , Wu C., Wilson S. 1987 , Nakai A., Morimoto R. 1993 , Nowak T.S., Jacewicz M. 1994 , Scharf K.-D., Rose S. 1990 , Schuetz T.J., Gallo G.J. 1991 ].

В экспериментальных моделях с фокальной ишемией мозга установлено, что экспрессия гена основного стресс-белка - белка HSP72 - регистрируется в ограниченной области мозга с уровнем снижения мозгового кровотока ниже 50% от нормы и только в клетках, остающихся жизнеспособными. Соответственно в ядерной зоне ишемии экспрессия гена hsp72 отмечается преимущественно в клетках эндотелия сосудов, более резистентных к ишемии; в маргинальной области инфаркта - и в глиальных клетках, в зоне пенумбры - и в нейронах [